Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
В процессе изучения нуклеиновых кислот методом электрофореза выяснилось, что на их электрофоретическую подвижность сильно влияет конформация. Фишер и Дингман [384] отметили, что подвижность полинуклеотидов при электрофорезе зависит не только от их размеров, но также от температуры и напряжения, при которых проводится разделение. Они обнаружили также, что поведение одноцепочечных и двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот при электрофорезе сильно различается. В то время как для одноцепочечных РНК значение Кт на графиках Фергюсона является функцией молекулярной массы, для двухцепочечных молекул эта величина очень мало зависит от молекулярной массы. Авторы пришли к выводу, что двухцепочечные молекулы мигрируют в геле концом вперед, т. е. в таком положении, при котором лобовое сопротивление невелико. Аналогичные результаты были получены и в другой работе [533] (рис. 124). Недавно Лишанская и Мазовицкий
О 2 4 6 8 10 12
Расстояние от старта, сл*
Рис. 124. Зависимость электрофоретической подвижности ДНК в агарозном геле от молекулярной массы [533, 534]. Л. Сравнение подвижности одноцепочечных (оц-ДНК) и двухцепочечных (дц-ДНК) в 0,6%-ном геле. Точки для двухцепочечных ДНК показывают положение маркерного красителя, соответствующее половине молекулярной массы ДНК- Были использованы двухцепочечные ДНК следующих фагов: Т5 (¦), Р1 (#), fai (А) и ЯЬ2Ь$ (Ў). Источником одноцепочечных ДНК служили фаги Р1 (О), Хс, (Л), А,Ь2Д>5 (V) н U (?). Б. Влияние концентрации геля на электрофоретическую подвижность одноцепочечных ДНК. Денатурированную ДНК фага Т5 (О) подвергали электрофорезу в агарозных гелях с концентрацией 0,6, 0,8, 1,0 и 1,5%.
/ 2 3*5
Подвижность, смг/(В-с)
Рис. 125. Электрофорез нуклеиновых кислот в гелях, содержащих форм-амид [1226]. Использованы следующие нуклеиновые кислоты (перечислены в порядке возрастания их молекулярных масс): тРНК Е. coli, 16S-рРНК Е. coli, 18S-pPHK ретикулоци-тов кролика, 18S-pPHK дрожжей, 23S-pPHK Е. coli, РНК фага u2, 28S-рРНК дрожжей, 28S-pPHK ретикуло-цитов кролика, РНК вируса табачной мозаики.
[773] сообщили, что скорость миграции двухцепочечных молекул ДНК зависит от их молекулярной массы, если электрофорез проводится при низком напряжении (Е<4 В) в разбавленных полиакриламидно-агарозных гелях (соответственно 1 —1,5 и 0,5%). Было предпринято несколько попыток устранить различия в конформации нуклеиновых кислот. С этой целью нук-леиновые^ кислоты обрабатывали формальдегидом и проводили электрофорез также в присутствии 1%-ного формальдегида [145, 481]. Однако такая обработка неполностью устраняла структурные различия. Позднее Стайнов и др. [1226] предложили использовать в качестве денатурирующего агента формамид. Поскольку формамид вызывает полное разрушение вторичной структуры полинуклеотидов [543, 544, 1309], в его присутствии подвижность полинуклеотидов не зависит от их исходной конформации.
Перед использованием формамид деионизируют, перемешивая его в течение 45 мин с 3%-ной суспензией дауэкс 50W-X8 (20—50 меш, Н-форма). За этот период проводимость падает примерно от 600 до 20 мкСм на 1 см. Дауэкс удаляют путем фильтрования. Гель имеет следующий состав: 4% Т, 15% С, 0,2 ТЕМЭД, 0,012% персульфата аммония и 0,02% NaCl. NaCl и ТЕМЭД растворяют в минимальном объеме воды, так чтобы концентрация формамида составляла не менее 2%.
Гоулд и Хэмлин [457] слегка модифицировали исходный метод Стайнова и др. [1226]. Они рекомендуют забуферивать формамид 0,02М диэтилбарбитуровой кислотой до pH 9,0, а затем деионизировать его с помощью амберлита. Для точного определения молекулярной массы следует построить калибровочную кривую, используя для этого полинуклеотиды с известными молекулярными массами (рис. 125).
II 1.3. Электрофорез нуклеопротеидных частиц
Для изучения нуклеопротеидных частиц, таких, как рибосомы, полирибосомы, ДНП-частицы или вирусы, обычно применяют методы седиментации. Тем не менее в некоторых случаях полезная информация для характеристики этих частиц может быть получена и с помощью электрофореза.
Частицы рибонуклеопротеидов разделяют методом электрофореза в градиенте концентрации сахарозы [764, 1273], а
ДНП-частицы — на полосках ацетата целлюлозы [705].
Для характеристики и выделения РНП-частиц (главным образом рибосом и субчастиц рибосом) применяют также электрофорез в агаровом геле [292, 1273].
Иертен и др. ([569] первыми использовали электрофорез в полиакриламидном геле для анализа РНП-частиц. Они проводили аналитическое и препаративное разделение 50S- и 30S-cy6-частиц рибосом Е. coli в геле, содержащем 4% Т и 1% С. При снижении концентрации акриламида примерно до 2% в геле образуются поры таких размеров, которые позволяют проводить электрофоретический анализ полирибосом. Дальберг и др.
[267] успешно разделяли полирибосомы, состоящие приблизительно из десяти рибосом, в 2,25%-ном полиакриламидном геле, содержавшем 0,5% агарозы. Этот метод электрофореза отличается высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать изменения в структуре полирибосом, вызванные антибиотиками
