Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Ядерные эмульсии, используемые в биологических исследованиях
Ядерная эмульсия отличается от обычной фотопленки главным образом высоким содержанием зерен галогенида серебра в желатине (приблизительно равные количества галогенида серебра и желатины) и небольшим размером зерен (0,02—0,3 мкм). Обычно используют эмульсионные детекторы трех типов: нанесенные на предметное стекло, жидкие и покрывающие. Первый
* Все фотопленки представляют собой суспензию кристаллов галогенида серебра в желатине. Эти кристаллы обладают тем необычным свойством, что при воздействии света или радиации они активируются и приобретают способность под действием различных восстанавливающих агентов (проявителей) превращаться в металлическое серебро. В отсутствие такой активации они устойчивы к химическому восстановлению.
РИС. 6-1.
Л—авторадиограмма, показывающая концентрацию радиоактивности в ядрах, выделенных из матки морской свинки, которая в течение 15 мин подвергалась действию 1,2,6,7-3Н-прогестерона. Ядра помещали на предметное стекло и покрывали ядерной эмульсией. Через 11 дней автоградиограмму проявляли для того, чтобы сделать видимыми гранулы серебра, а затем окрашивали метиловым зеленым с пиронином для проявления ядер. Видно, что прогестерон или соединение, образующееся из прогестерона, быстро локализуется в ядрах клеток матки. Увеличение 1100Х. (Stumpf W., in “Methods in Cell
Biology”, vol. 3, ed. by D. M. Prescott, Academic Press, 1976.) Б — авторадиограмма среза гиппокампа крысы, показывающая концентрацию 3Н-корти-костерона в ядрах нейронов через 1 ч после внутривенного введения. После нанесения тонкого среза на стеклянную пластину он был введен в контакт с ядерой эмульсией, и авторадиограмму экспонировали 95 дней, проявляли, затем окрашивали метиловым зеленым с пиронином, чтобы сделать видимыми ядра. Высокая концентрация зерен над ядрами показывает, что большая часть кортикостерона находится в ядрах. Кроме того, зерна находятся и между ядрами. Чтобы определить, происходят ли они от 3Н или причиной их служит фон, необходимо выяснить число зерен на единицу площади эмульсии в месте, далеком от среза ткани. (Stumpf W. Е., Sar М., in “Methods in Enzymology”, vol. 36, edited by B. W. O’Malley and J. G. Hardman, Academic Press, 1975.) В — авторадиографическое определение синтеза ДНК в клетках животных. Клетки почки африканской зеленой обезьяны выращивали в течение 6 ч в питательной среде, содержащей 3Н-тимидин. Затем клетки отмывали, обезвоживали и покрывали авторадиографической пленкой. После экспонирования и проявления пленки ядра (серые участки) были окрашены. Такой эксперимент позволил установить, что репликация ДНК в данных клетках проходит в течение 6 ч (период, за который ядра покрываются зернами). Следовательно, так можно измерять долю реплицирующих клеток. (Любезно предоставил Джеймс А. Робб.)
тип детекторов представляет собой относительно толстый (250 мкм) слой эмульсии, нанесенный на предметное стекло микроскопа. Жидкий эмульсионный детектор — это гель, который готовят так: образец погружают в расплавленный гель и извле-
желатина + AgBr
желатина
стеклянная лласт инка
пластинка
образец
РИС. 6-2.
Методы нанесения эмульсии на образец.
А — метод погружения. Предметное стекло микроскопа с нанесенным образцом погружается в расплавленную эмульсию. Тонкий слой покрывает стекло и застывает при комнатной температуре; Б— метод покрывающей пленки. Готовые стеклянные пластинки с нанесенной на них пленкой размечают лезвием бритвы на прямоугольники размерами приблизительно 25X75 мм. Пленку снимают с пластинок тем же лезвием, вводя его под пленку. Пленку переворачивают, помещают на поверхность воды и поднимают, как показано на рисунке; В — поперечный разрез готовой пластинки с образцом и эмульсией, изготовленной методом покрывающей пленки. I — погружение пластинки в эмульсию; 2 — сушка; 3 — поперечный разрез пленки; 4 —удаление пленки с пластинки;
В — пленку поворачивают лицевой стороной вниз и помещают на поверхность воды; 6 — пленку оставляют набухать; 7 — пластинку с образцом вводят под пленку, находящуюся на поверхности воды; 8 — подъем; 9 — поперечный разрез готовой пластинки.
кают, эмульсия затвердевает и образует пленку, толщина которой зависит от концентрации желатины в жидкости. Покрывающий эмульсионный детектор — это тонкая (около 5 мкм) пленка, нанесенная на стекло. Ее отделяют от стекла ножом и помещают на поверхность воды. Образец, предварительно нанесенный на предметное стекло микроскопа, помещают под плавающую пленку и поднимают вместе с ней, нанося таким образом эмульсионную пленку на стекло микроскопа. После сушки эмульсия тонким слоем плотно покрывает стекло. Эта операция показана постадийно на рис. 6-2.
Изотопы, обычно используемые в биологических и биохимических исследованиях
Чаще всего используют радиоактивные изотопы с тремя типами энергий: высокой (например, 32Р), средней (например, 14С и 35S) и низкой (например, 3Н). Почти все они являются р-излуча-телями. Иногда применяют и а-излучатели, такие, как полоний или торий. Авторадиографические свойства этих изотопов будут обсуждаться в следующем разделе.
