Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Новейшие приборы, снабженные компьютерами, сконструированы таким образом, чтобы использовать метод внешней стандартизации и автоматически вносить поправку на тушение до вывода данных на печатающее устройство.
Если образец затушен и содержит две метки, для определения тушения требуются специальные приемы (если такое определение возможно). Описание таких методов обычно приводится в инструкции к счетчикам или в специальной литературе, ссылки на которую приведены в конце этой главы.
Третий метод определения эффективности — метод внутренней стандартизации — заключается в следующем. После счета образца к нему добавляют известное количество меченого соединения, не дающего тушения, после чего образец считают вновь. Эффективность счета рассчитывают исходя из отношения наблюдаемой радиоактивности к известной. Хотя этот метод и выглядит безупречным, все же и здесь существуют две проблемы: 1) объем прибавляемого вещества, как правило, настолько мал, что при его измерении допускается значительная (3—5%) ошибка, и 2) образец после этого становится непригодным для повтор-
Каналы А Б
Энергия
стандарта
РИС. 5-7.
А — сдвиг спектра, вызываемый тушением; каналы остаются постоянными. Б — кривая для коррекции тушения методом отношения каналов. В—кривая для коррекции тушения методом внешней стандартизации.
1 — без тушения; 2 — с тушением.
ных измерений. Метод внутренней стандартизации используют редко, поскольку он обладает указанными выше недостатками и требует однообразной утомительной работы.
Методы внутренней и внешней стандартизации могут использоваться для поправки на световое тушение и тушение за счет разбавления. Однако проще прибегать к окислению окрашенных образцов Н2О2, что обычно приводит к устранению окраски. Тушение же за счет разбавления удобнее учитывать с помощью ряда последовательных разбавлений образца сцинтилляционным раствором. Затем строят график зависимости радиоактивности в единице объема от концентрации образца и проводят экстраполяцию к нулевой концентрации. Этот метод требует довольно ¦больших затрат времени, но дает вполне удовлетворительные результаты.
Очень важно не смешивать понятия самопоглощения и тушения. Корректировка тушения, обсуждавшаяся выше, вносит поправку только на изменения p-спектра, связанные со свойствами сцинтилляционного раствора, и не дает информации о степени самопоглощения. При работе с нерастворимыми образцами или частицами, собираемыми на фильтре, потери будут вызываться ¦физическими свойствами самого образца *. Вообще самопогло-щение является сложной проблемой и часто служит главной причиной низкой эффективности счета. Это относится в особенности к изучению таких макромолекул, как белки и нуклеиновые кислоты, поскольку наиболее общей методикой приготовления ¦образцов является осаждение макромолекулы кислотой (соляной, хлорной или трихлоруксусной) и отделение осадка на ¦фильтре. При наличии самопоглощения некоторого увеличения эффективности счета удается добиться с помощью уменьшения размеров образца, если образец очень велик, и при фильтровании, так как осадок может образовывать толстый слой. Однако разбавление не всегда устраняет самопоглощение вследствие того, что большинство веществ и без того имеет минимальный размер частиц, который не уменьшается при разбавлении. К сожалению, в случае р-частиц с низкой энергией, таких, как у 3Н, •самопоглощение, обусловленное такими микрочастицами, всегда вносит некоторый вклад. Вообще самопоглощение не может быть устранено никаким другим методом, кроме переведения исследуемого вещества в раствор.
* На первый взгляд может показаться, что все дело заключается в •фильтре, поскольку материал фильтра способен задерживать проходящие через него Р-частицы. Однако, как это ни парадоксально, значение фильтра невелико, так как на счет нерастворимых образцов мало влияет то, что они ¦находятся на фильтре. Предполагают, что частицы расположены на поверхности фильтра и при этом практически окружены растворителем.
Наилучшим способом счета относительных количеств радиоактивности в различных нерастворимых образцах является тот, который позволяет получить все образцы максимально близкими по свойствам. Один из таких методов состоит в прибавлении известного количества осаждающегося материала (например, ДНК или альбумина бычьей сыворотки) к каждому образцу таким образом, чтобы уменьшить различия в количествах осадка в серии образцов. Если приходится сравнивать растворимый образец с нерастворимым (например, при сравнении удельных радиоактивностей белка и аминокислоты, используемой в синтезе), единственным путем для получения высокой точности служит растворение образцов и счет их в идентичных смесях.
Следует сказать несколько слов о предосторожностях, которые надо соблюдать при растворении образцов на фильтрах. Если нерастворимый образец на фильтре поместить в растворитель, способный растворять материал фильтра (например, диок-сан для нитроцеллюлозных фильтров), иногда может показаться, что образец растворяется, хотя в действительности растворяется только фильтр, а образец продолжает оставаться в прежнем состоянии. Таким образом, этот прием не устраняет проблемы са-мопоглощения.
