Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Регистрация глучей
^-Радиоактивные препараты в последнее время приобрели большое значение в биохимии и особенно в радиоиммунологических исследованиях {гл. 10), при которых антитела или другие белки часто метят ^-радиоактивным 1251. Этот вид излучения легко регистрируют и измеряют радиоактивность у-излучателей с помощью производимых серийных у-счетчиков, где применяется внешний сцинтилляционный детектор, который работает по следующему принципу. Образец помещают в стеклянный или пластмассовый флакон и вводят внутрь большого кристалла Nal, активированного таллием [Nal (Т1)]; это носит название счета в колодце (рис. 5-8). Поскольку улучи имеют очень высокую энергию, они выходят за пределы образца и флакона без заметной потери энергии. С выходом в несколько процентов за время прохождения через кристалл они приводят к появлению электронов. Эти электроны в свою очередь возбуждают близлежащие части кристалла, в результате чего возникает флуоресценция, регистрируемая фотоумножителями. Как и в жидкостном сцинтил-ляционном методе, соответствующая электронная аппаратура превращает свет в регистрируемые электрические импульсы. При измерении 7-радиации нет необходимости в схеме совпаде-
РИС. 5-8.
Колодезный счет улучей.
у-Лучи взаимодействуют с кристаллом, давая р-частицы, которые возбуждают кристалл с последующим образованием фотонов (hv), которые могут регистрироваться фотоумножителями. / — монокристалл Nal(TI); 2 — фотоумножители.
ний, поскольку энергия улучей настолько велика по сравнению с шумом фотоумножителей, что напряжение, определяемое низшим уровнем анализатора амплитуды импульсов (т. е. L1 в жидкостном сцинтилляционном методе), может устанавливаться выше импульсов фона. Обычно система оснащается несколькими фотоумножителями, действующими независимо, для повышения эффективности счетчика.
Как и при жидкостном сцинтилляционном счете, в случае уизлучающих источников возможно проведение экспериментов с двойной меткой. Аналогичным образом, поскольку величины импульсов зависят от энергии улучей, можно использовать анализ амплитуды импульсов для одновременного определения различных изотопов — например, 1251 и 1311. Подробное обсуждение успектрометрии можно найти в литературе, список которой приведен в конце главы.
Примеры использования радиоактивных препаратов
Этот раздел включает ряд примеров использования радиоактивности в биохимии и молекулярной биологии. Радиоактивные изотопы могут применяться: 1) для обнаружения веществ в количествах, слишком малых для прямого химического обнаружения, 2) для различения идентичных молекул, находящихся в различных участках биоструктур, 3) для анализа смесей, которые слишком сложны для традиционного химического анализа, и 4) для установления участия в реакции, когда продукты невозможно отличить от реагентов химическими методами. Первая ситуация иллюстрируется примерами 5-В и 5-3, вторая — 5-Б и 5-Д, третья— 5-Е и 5-Ж и четвертая — 5-И.
Пример 5-Б. Реакции ДНК-полимеразы I Escherichia coli. Если очищенную ДНК-полимеразу I прибавить к реакционной смеси, содержащей буфер, Mg2+, ДНК и четыре дезоксирибо-нуклеозид-5'-трифосфата (аденина, тимина, гуанина и цитозина), меченных 32Р в a-положении (ближайшем к остатку дезокси-рибозы), и инкубировать при 37°С, вещество, содержащее 32Р> становится нерастворимым в 10%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ) и может быть отделено на мембранном фильтре, что указывает на образование из трифосфатов ДНК, поскольку именно ДНК в отличие от нуклеозидтрифосфатов нерастворима в ТХУ. Заметим, что вновь синтезированная ДНК отличается от матричной ДНК благодаря своей радиоактивности. Если присутствуют только три дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфата, или при отсутствии Mg2+ или ДНК» или в том случае, когда вместо дезоксири-бонуклеотидов взяты рибонуклеотиды, 32Р остается в растворе. Отсюда следует, что полимеризация требует присутствия всех четырех дезо/со/рибонуклеозид-5'-трифосфатов, ионов Mg2+ и ДНК. При замене одного из трифосфатов на моно- или дифосфат 32Р также остается в растворе (т. е. полимеризация не идет); следовательно, необходимо наличие в субстрате именно трифос-фатной группы. Если дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты несут 32Р и р- или ^-положении и 14С в остатке дезоксирибозы, 14С, а не 32Р становится нерастворимым в кислоте. (14С и 32Р можно различить методом жидкостного сцинтилляционного счета.) Это означает, что р- и у~фосфатные группы отщепляются во время реакции, а в полимере остаются только а-фосфатные группы. Таким образом, использование радиоактивности позволяет различить определенные фосфатные группы.
Пример 5-В. Определение молекулярной массы ДНК с помощью метки по концевой группе. Фермент полинуклеотидкиназа
из Е. coli переносит уфосфат с аденозин-5'-трифосфата (АТФ) на 5'-концевую гидроксильную группу ДНК. Обычно ДНК содержит два 5'-фосфорильных конца (по одному в каждом поли-нуклеотидном тяже), которые могут быть превращены в 5'-гид-роксильные группы под действием фермента щелочной фосфата-зы. В лаборатории при университете Брандейс 4,7 мкг очищенной гомогенной (в том смысле, что все молекулы были одного размера) ДНК фага К с 5'-гидроксильными концами вводили в реакцию с у32Р-АТФ с удельной радиоактивностью 3 мКи/мкмоль, используя полинуклеотидкиназу. После осаждения кислотой образец показал радиоактивность 1870 имп/мин при использовании счетчика с 85%-ной эффективностью по 32Р. Таким образом, осадок содержал 1870/0,85 или 2200 расп/мин 32Р. В единицах микрокюри это составляет 2200/(2,2-10е) = 10-3 мкКи. Из удельной радиоактивности 10-3 мкКи эквивалентно 3,3-10-7 мкмоль АТФ или 1,98-10й молекул. Так как было прибавлено 4,7 мкг фага X ДНК, масса одной молекулы фага А, ДНК составляет 4,7/(9,9--1010) =4,7 -10—11 мкг, или 31,0 -106 единиц атомной массы. В данном случае радиоактивность служит для высокоточного измерения фосфорилирования 5'-гидроксильных групп. Этим же способом можно отличить новые концевые фосфорильные группы от старых 5'-фосфорильных групп.
