Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Пример 5-Г. Идентификация «скрытых» остатков тирозина в гипотетическом белке. Тирозин является единственной аминокислотой, которая может иодироваться. Пусть гипотетический белок по данным аминокислотного анализа содержит шесть остатков тирозина. При реакции 1 мкг такого белка с 1311 можно было осадить трихлоруксусной кислотой и отделить на фильтре из стекловолокна препарат с радиоактивностью 2550 имп/мин. Если же реакцию проводили в присутствии денатурирующего агента при полном нарушении третичной структуры белка, в осадке наблюдали радиоактивность, равную 3820 имп/мин. Следовательно, имеются (2550/3820)-6«4 остатка тирозина, способных иодироваться в случае, когда белок обладает нативной конфигурацией. Отсюда 6—4 = 2 остатка тирозина недоступны и, следовательно, «скрыты» в трехмерной структуре. В этом случае радиоактивность позволяет определить иод в белке в количествах, слишком малых для определения химическими методами.
Пример 5-Д. Проницаемость бактерий для адениловой кислоты (АМФ). Не все радиоактивные препараты, будучи прибавлены к бактериальной культуре, могут проникать в бактерии. Если радиоактивное вещество все же попало в бактерию и бактерия затем отделена фильтрованием, радиоактивность будет проявляться на фильтре. Если же этого не произошло, радиоактивность пройдет через фильтр и осадок может быть полностью от-
мыт от нее. Например, при добавлении 32Р-АМФ или 3Н-АМФ (с 3Н в пуриновом кольце) к культуре бактерий Е. coli после периода роста бактерии отделяли на мембранном фильтре и промывали буфером. В результате на фильтре не было обнаружено ни 3Н, ни 32Р. Следовательно, АМФ не включается в бактерию. Кроме того, можно различить прибавленный АМФ и АМФ, который всегда присутствует в клетках. Если бы в клетки включалось количество АМФ, равное 0,1% от всегда присутствующего в бактерии, увеличение на такое количество не могло бы быть определено химическими методами. При использовании же радиоактивного материала 0,1%-ное количество легко определить на нулевом фоне нерадиоактивного внутриклеточного АМФ.
Так как в этом примере применялся как 32Р-АМФ, так и 3Н-АМФ (с 3Н в пуриновом кольце), отсутствие включения обеих меток дает возможность сделать также вывод о том, что клетки не расщепляют внешний АМФ с образованием аденозина и фосфата, поскольку известно, что оба эти вещества способны проникать в клетку. Это существенно в связи с тем, что имеются случаи, когда перед попаданием в клетку вещество подвергается расщеплению, например тимидин расщепляется с образованием тимина.
Пример 5-Е. Идентификация вещества по реакции с антителом. Если бактерию Е. coli, растущую на среде, где единственным источником углерода служит 14С-глюкоза, инфицировать фагом Т4 и зараженные клетки выращивать дальше, то синтезируются фагоспецифические белки. Если зараженные клетки разрушить и добавить антитела, специфичные к очищенным белкам отростка фага Т4, наблюдается осаждение 14С. Если клетки разрушать через различные промежутки времени, по количеству осаждаемого ИС можно определить зависимость скорости синтеза белков отростка от времени. Аналогичный анализ можно провести и для клеток, инфицированных фагом Т5, с антителами, специфичными к белкам отростка фага Т5. Однако, если клетки одновременно инфицировать фагами Т4 и Т5 и вслед за этим разрушить, ИС будет осаждать антитела, специфичные к фагу Т4, по не к фагу Т5. Следовательно, белки отростка фага Т5 не синтезируются в условиях такого двойного заражения. Такой эксперимент практически невозможно провести без использования радиоактивной метки, поскольку приходится идентифицировать малое количество белков отростка в чрезвычайно сложной смеси, представляющей собой лизат клеток плюс антисыворотку.
Пример 5-Ж. Очистка белка, для которого нет подходящих химических или биологических методов тестирования. Белки обычно определяют, измеряя их биологическую активность (например, ферментативную или ингибирующую в некоторых реак-
Номер фракции
РИС. 5-9.
Использование техники двойной метки при очистке белка.
Неиндуцибельный лизогенный штамм бактерии Е. colt подвергали УФ-облучению, чтобы подавить синтез белка. Затем клетки инфицировали диким видом фага К в присутствии 311-лсйцина или ^clsusio (который отвечает за синтез короткого фрагмента Л-репрес-сора) в присутствии мС-лейцина. Белки выделяли из каждой культуры, смешивали и хроматографировали на ДЭАЭ-целлюлозе (гл. 8). Кривая элюирования с хроматографической колонки показана в виде количеств 3Н и МС в каждой фракции, элюируемой с колонки. Пик радиоактивности 3Н не сопровождается соответствующим пиком 14С и отвечает белку, синтезируемому при заражении фагом X дикого типа, но не заражению XcIsusIO, т. е. Л-релрессору. Таким образом впервые было проведено обнаружение А-репрессора. # 3Н; О МС. (Любезно предоставил Марк Пташне.)
циях) или на основании физических свойств, позволяющих различать отдельные белки (таких, как спектральные свойства гемоглобина). Однако когда определение такими методами невозможно, то используют методику двойной метки, описанную ниже. Если инфицированную фагом бактерию, способную продуцировать определенный белок, выращивать в среде, содержащей 3Н-лейцин, все ее белки будут включать 3Н. Если же выращивать в среде с 14С-лейцином мутантную бактерию, продуцирующую только фрагмент какого-либо белка, все белки будут включать метку, но не будут образовывать интересующего нас 14С-меченого интактного белка. При смешивании меченных таким образом двух культур и выделении общего белкового препарата фракционирование с помощью хроматографии приведет к тому, что большинство фракций будет обладать фиксированным отношением 3Н/14С. Интересующий нас белок будет при этом находиться во фракции с наибольшим отношением 3Н/ИС (рис. 5-9). Следовательно, схема очистки может быть основана на достижении максимального значения этого отношения так, чтобы в ито-
