Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Метод постоянного контакта
Обычно используют три варианта метода постоянного контакта: нанесение на предварительно подготовленную эмульсию, покрывание предварительно расплавленной эмульсией или погружение в нее и использование покрывающей пленки.
Нанесение на предварительно подготовленную эмульсию
В этом варианте каплю образца высушивают на эмульсии или срез ткани смачивают водой и эмульсию (нанесенную на стеклянную пластину) вводят под него таким образом, чтобы ткань лежала на эмульсии. Этот очень простой метод имеет три недостатка: 1) проявление может оказаться неоднородным, так как проявитель должен проникать через образец, 2) зерна и треки должны быть видны сквозь образец и 3) для такой эмульсии характерен высокий уровень фона. С другой стороны, этот вариант отличает высокая чувствительность. Если образец состоит из радиоактивных частиц, которые можно разбавить так, что разрешение перестает быть проблемой, и целью авторадиографии является подсчет частиц, метод дает прекрасные результаты. Чув* ствительность здесь можно увеличить вдвое, если покрыть нанесенный образец сверху дополнительным слоем жидкой эмульсии. Рассмотрим ставший классическим эксперимент с использованием данного метода.
РИС. 6-7.
Звезда.
Бактериофаг, меченный 3-Р, внедряли в эмульсию. Все треки р-частиц 32Р исходят из одной точки, что позволяет подсчитать число треков (лучей) на звезду. Подсчет всех лучей необходимо проводить с помощью микроскопа, смещая фокус вверх и вниз, чтобы заметить те, которые находятся не в одной плоскости с источником. (Любезно предоставил Чарльз Л. Томас.)
Пример 6-А. Определение числа молекул ДНК в бактериофаге — так называемый эксперимент «звезда». ДНК бактериофага Т2 Escherichia coli метили 32Р до очень высокой радиоактивности— приблизительно 100 атомов 32Р на фаг. Затем из части фагов экстрагировали ДНК и на эмульсию наносили два образца:
1) аликвоту, содержащую некоторое количество фаговых частиц, и 2) аликвоту, содержащую ДНК, выделенную из того же количества фагов. Затем образцы заливали сверху жидкой эмульсией таким образом, что они оказывались погруженными в эмульсию. После экспонирования и проявления в эмульсии наблюдали плотные треки, выходящие из одной точки (рис. 6-7). Они представляют собой следы р-частиц 32Р, излучаемых единичной фаговой частицей или молекулой ДНК- Их расположение носит название «звезды». При этом было найдено, что среднее число звезд на
каплю одно и то же для ДНК и фага, откуда следует предположение, что на молекулу фага приходится только одна молекула ДНК. Если бы в фаге имелось две молекулы ДНК равного размера, то число звезд в образце ДНК было бы двойным по сравнению с образцом фага. Однако, если бы фаговая частица включала бы в себя, например, одну молекулу ДНК, соответствующую 80% ДНК фаговой частицы, и десять других молекул ДНК, соответствующих каждая 2% ДНК фаговых частиц, то короткие ДНК не давали бы звезд (их нельзя было бы распознать, поскольку они редко давали бы более чем один трек) и число звезд в фаговых частицах и свободных ДНК было бы одинаковым. Однако было подсчитано число лучей (треков) на звезду, оказавшееся одним и тем же для ДНК и для фага. Следовательно, как ДНК, так и фаг содержали одно и то же число атомов 32Р, откуда следует, что в фаге была только одна молекула ДНК. Конечно, в таком эксперименте потребовалось определить число лучей на звезду с большой статистической точностью, с тем чтобы можно было надежно отличить 80% от 100 %.
Метод погружения
Образец наносят на предметное стекло микроскопа и погружают вместе с ним в расплавленную эмульсию (рис. 6-2). Этот метод дает возможность осуществить наиболее тесный контакт между образцом и эмульсией, что приводит к максимальной эффективности при работе с эмиттерами, обладающими низкой энергией. К достоинству метода следует отнести возможность получения очень тонкой эмульсии при соответствующем разбавлении и выборе температуры; при этом подготовка образца отличается быстротой и простотой, и жидкая эмульсия позволяет получить зерна галогенида серебра с минимальным размером, что приводит к увеличению разрешения отдельных зерен. Недостатками метода являются неравномерная толщина эмульсии, но это не сказывается при использовании 3Н, поскольку, как было показано ранее, р-частицы 3Н редко проникают в кристаллы глубже чем на 1 мкм.
Способность метода погружения разрешать отдельные р-частицы от3Н замечательна. Отсюда следует применение метода для определения относительного количества ДНК (по 3Н-тимидину) в клетках, растущих в различных условиях. Это показано в следующем примере.
Пример 6-Б. Демонстрация того, что аминокислотное голодание предотвращает реинициацию цикла синтеза ДНК в бактерии. Если штамм бактерии Е. coli, требующий для роста тимин и лейцин, растет в среде, которая содержит 3Н-тимидин (3H-dT), яв-
РИС. 6-8.
Авторадиограмма бактерии, меченной 3Н-тимидином.
Каждое зерно отражает распад одного ядра 3Н. Бактерия и зерна находятся в образце на разных уровнях, что затрудняет одновременное фокусирование микроскопа на клетках и зернах. На рисунке в фокусе находятся зерна, поэтому бактерия выглядит расплывчатой. (Любезно предоставил Уильям Хоув.)
