Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фрайфелдер Д. -> "Физическая биохимия " -> 52

Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия — М.: Мир, 1980. — 580 c.
Скачать (прямая ссылка): fizicheskayabiohimiya1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 218 >> Следующая

радиограммы таких клеток при митозе показывают, что все зер-на локализуются над хромосомами (рис. 6-9). Если после введения метки в больших количествах продолжать выращивание клеток на нерадиоактивной среде в течение некоторого времени, авторадиограммы образцов, отбираемых через различные промежутки времени, показывают, что после одного поколения в клетках имеются при митозе дочерние хромосомы, содержащие радиоактивность, но число зерен на хромосому равно только половине такого числа для-первоначальной хромосомы. После многократной смены клеток число зерен на хромосому остается постоянным и равным половине числа зерен для первоначальной хромосомы, причем две меченые парные хромосомы никогда не разделяются в течение анафазы. Таким способом Дж. Герберт Тейлор показал, что хромосомы содержат две субъединицы, которые разделяются при первом делении после синтеза и после этого сохраняются. Этот результат находится в соответствии с экспериментом Ме-зельсона — Шталя, если субъединицы представляют собой индивидуальные полинуклеотидные тяжи ДНК.
Молекулярная авторадиография
В принципе авторадиография служит для локализации радиоактивности в клетках или тканях. Однако существует возможность использовать авторадиографию для того, чтобы сделать молекулы видимыми, или для определения их физических параметров.
РИС. 6-10.
Авторадиограмма реплицирующейся хромосомы Е. coli. (Любезно предоставил Джон Кейрнс.)
>¦ i
I * 4
L* ' ' .] * ***
* *4 i
Ш::!
V.: *"M
В этом случае она носит название молекулярной авторадиографии. (Первый случай такого применения метода приводился в примере 6-1, где была определена молекулярная масса молекулы ДНК фага.) Этот эффективный метод не нашел широкого применения и ограничен пока рядом исследований структуры ДНК с целью получения информации, которая не может быть получена из данных других методов. Хорошо известный пример приводится ниже.
Пример 6-Г. Наблюдение репликации молекулы ДНК Е. coli. Джон Кейрнс выращивал бактерии Е. coli в течение многих поколений в среде, содержащей 3H-dT; затем он выделял нефрагментированную ДНК, растягивал ее путем адсорбции на фильтре из нитроцеллюлозы (гл. 7) и получал авторадиограммы методом покрывающей пленки. Примеры полученных им прекрасных картин приведены на рис. 6-10. Авторадиограммы показали, что молекула ДНК Е. coli представляет собой кольцо, и дали длину молекулы. [Хотя молекулы ДНК довольно легко можно увидеть в электронном микроскопе (гл. 13), электронная микроскопия таких больших молекул (М = 2,6-109) в расправленном виде невозможна, поскольку приготовление образца для электронной микроскопии приводит к разрывам в ДНК.
Если же условия приготовления образца позволяют избежать разрывов, молекула при этом запутывается.]
При некоторой модификации данного эксперимента можно показать, в какой части молекулы происходит репликация (эта информация необходима для построения модели репликации). Это можно сделать путем выращивания клеток за промежуток времени, немного превышающий продолжительность одной генерации, в среде, содержащей 3Н-сЛ\ После одной генерации метка включается только в один тяж ДНК; однако продолжающаяся репликация в течение дополнительного короткого промежутка времени приводит к образованию коротких отрезков ДНК, содержащих %H-dT в обоих тяжах. Следовательно, ДНК, реплицирующаяся во второй генерации, будет иметь двойную плотность зерен (число зерен на единицу длины) по сравнению с остальной. Таким образом дважды реплицированная ДНК была идентифицирована авторадиографически и, как и ожидалось, она всегда соседствовала с репликативными вилками. Важным результатом явилось наблюдение двух участков с двойной плотностью зерен, присоединенных к каждой вилке. Из этого следует, что обе вилки были способны к росту, т. е. ДНК реплицируется по двум направлениям (рис. 6-11).
Авторадиография и электронная микроскопия
Обычно авторадиограммы изучают с помощью обычного микроскопа. Люсьен Каро и Роберт ван Тюберген разработали метод, позволяющий использовать электронный микроскоп с высоким разрешением. Для этого необходимо применять очень тонкий слой эмульсии, который бы не препятствовал наблюдению образца в электронный микроскоп. Тонкий срез ткани или клетку, заделанную в пластмассу и адсорбированную на решетке для электронного микроскопа, погружали в эмульсию, разбавленную настолько, чтобы наносился только монослой кристаллов галогени-да серебра. При этом использовали очень мелкие (<0,1 мкм) кристаллы. После экспонирования и проявления срез ткани окрашивали уранилацетатом и изучали с помощью электронного микроскопа (рис. 6-12). Такой метод позволяет получить разрешение до 0,1 мкм. До сих пор метод использовали редко, но он явно заслуживает большего внимания.
Б
РИС. 6-11.
А — авторадиограмма целой хромосомы Е. coli, полученная при введении тритироваиного тимидина в синхронную культуру чувствительного к температуре, дефектного по инициации штамма, во время вступления в синхронный
Предыдущая << 1 .. 46 47 48 49 50 51 < 52 > 53 54 55 56 57 58 .. 218 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed