Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Поскольку большинство зерен образуется ближе к концу трека, эффективность зависит также и от толщины эмульсии. Действительно, в случае 32Р существует прямая зависимость между эффективностью и толщиной эмульсии вплоть до толщины 50— 100 мкм. Для !4С максимальная эффективность достигается при толщине эмульсии 3—5 мкм. Поскольку (J-частицы 3Н имеют пробег только ~ 1 мкм, при использовании более толстых эмульсий ничего не меняется (в действительности могут возникать осложнения за счет увеличения фона).
Фон
Проявленные эмульсии, которые не были экспонированы радиоактивным образцом, содержат темные зерна, называемые фоном. Каким же образом идентифицировать трек в их присутствии?. Для изотопов с высокой энергией это делается легко, так как зерна треков достаточно плотны. Для 14С плотность зерен в треках варьирует от высокой до низкой. У специалистов в области авторадиографии принято считать, что требуется минимум четыре зерна на прямой линии, чтобы определить трек, поскольку такая комбинация крайне маловероятна в неэкспонированной эмульсии. Однако в случае 3Н трек обычно представляет собой одно большое зерно, поэтому необходимо понизить фон до очень малого уровня, для того чтобы получить возможность использовать этот изотоп.
Фон может быть обусловлен множеством причин: случайным попаданием света, присутствием в образце некоторых соединений и ионов металлов (особенно Си), механическим воздействием (легкое давление на непроявленную эмульсию вызывает сильное потемнение при проявлении), некоторыми условиями проявления, электрическими разрядами и фоновой радиоактивностью (например, 40К в стекле, 14С в желатине и космическими лучами). Имеется два вида фона — длинные треки и индивидуальные зерна. Длинные треки появляются большей частью в толстых эмульсиях. Для индивидуальных фоновых зерен плотность зерен (т. е. число зерен в единице объема) постоянна, а число зерен на единицу площади увеличивается с увеличением толщины эмульсии. В связи с этим крайне невыгодно применять эмульсию, толщина которой больше, чем необходимо для достижения максимальной эффективности; более того, часто бывает полезно пожертвовать эффективностью и использовать очень тонкие эмульсии для увеличения способности распознать греки — этим приемом обычно пользуются в случае 3Н.
Фон может появляться до внесения образца или во время экспонирования (т. е. во время между введением образца в контакт с эмульсией и проявлением) и проявления. Основной фон в виде треков легко устранить, если использовать жидкие эмульсии (см. разд. «Метод погружения»), поскольку треки (но не индивидуальные зерна) разрушаются при плавлении эмульсии. Основной фон в случае покрывающих пленок (см. следующий раздел) понижается вследствие того, что пленка содержит скрытый гаситель изображение (вещество, делающее эффект экспонирования зерен обратимым), который удаляется за время контакта с образцом, поскольку гаситель растворяется в воде, используемой для смачивания пленки. Фон, возникающий после
АВТОРАДИОГРАФИЯ HI
приложения образца, обычно сводится к минимуму скрупулезной аккуратностью и точным соблюдением правил хранения и проявления.
Методики осуществления контакта между эмульсией и образцом
Метод временного контакта
Образец вводится в соприкосновение с эмульсией, удерживается на месте в течение экспозиции с помощью давления и удаляется перед проявлением. Между образцом и эмульсией можно поме-
РИС, 6-6.
Л — авторадиограмма двумерной хроматограммы—электрофореграммы. Главную субъединицу вируса полиомы иодировали 1251 (эта реакция идет исключительно по остаткам тирозина) и затем подвергали действию трипсина. Продукты ферментативного гидролиза наносили на бумагу, хроматографировали и затем подвергали электрофорезу в направлении, перпендикулярном хроматографии. Бумагу высушивали и вводили в контакт с рентгеновской пленкой. Темные пятна на пленке соответствуют положениям пептидов, содержащих остатки тирозина (предоставил Уильям Мураками). Б — авторадиографическое определение зон на гель-электрофореграмме белков, содержащих 3Н-лей-цин. (Предоставил Юнко Хосода.)
стить тонкий защитный слой, чтобы предотвратить экспонирование за счет химически активных соединений в образце. Этот метод используется для идентификации пятен на хроматограммах и зон при электрофорезе в геле, а также при необходимости локализовать радиоактивные препараты в больших биологических объектах, таких, как листья, срезы костей и крупные срезы тканей. В качестве эмульсионного детектора здесь обычно применяют рентгеновскую пленку. При соблюдении некоторых условий метод позволяет получить полуколичественную информацию. Однако, поскольку зерна не могут быть экспонированы дважды, необходимо, чтобы экспонирование проводилось таким образом, чтобы почернение пленки было пропорционально количеству радиоактивности; если экспонирование ведется до тех пор, пока не проявятся области с очень малой активностью, области с высокой активностью могут выйти за пределы линейной зависимости почернения пленки от экспонируемой радиоактивности. Два примера использования этого метода показны на рис. 6-6. Заметим, что при работе с образцами такого типа нет необходимости использовать микроскоп, поскольку здесь не проводится подсчета зерен или треков.
