Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
ге получить фракцию, содержащую исключительно 3Н без примеси 14С. Если все белки включали метку, нужный белок при этом получается химически чистым (это, конечно, не так в случае клеток, инфицированных фагом, поскольку при этом большинство бактериальных белков будут нерадиоактивны).
Пример 5-3. Седиментационный анализ структуры ДНК бактериофага в суперинфицированной лизогенной бактерии. Если лизогенные фагом % бактерии Е. coli снова инфицировать фагом А, образования фага не наблюдается. Судьба входящей ДНК может быть определена путем выделения всех внутриклеточных ДНК и анализом смеси методом зонального центрифугирования в градиенте плотности (гл. 11). Анализ может быть основан на том факте, что ДНК фага К обладает молекулярной массой (3-107), отличающейся от молекулярной массы ДНК Е. coli (2,6*109), однако этот способ не совсем корректен, поскольку ДНК Е. coli в ходе выделения обычно расщепляется на фрагменты различной величины. Вопрос состоит в том, как отличить ДНК Е. coli и фага А,. Это легко осуществимо, если ДНК фага К будет радиоактивной, поскольку при анализе вся 'радиоактивность должна находиться только в ДНК фага Я. Поэтому для инфицирования лизогенных бактерий Е. coli можно использовать 3Н-А,. Суммарный препарат ДНК после выделения анализируют с помощью ультрацентрифугирования. После седиментации содержимое центрифужных пробирок фракционируют и определяют радиоактивность в каждой фракции. Данные, полученные в таком эксперименте, показаны на рис. 5-10, Л. Отсюда следует, что большая часть ДНК превращается в скрученные кольца, не способные к репликации. На рис. 5-10,5 показан результат, получаемый в том случае, когда не используется радиоактивный фаг. Поскольку соотношение бактериальной и фаговой ДНК составляет около 150, трудно распознать какой-либо пик из показанных на рис. 5-10, А.
Пример 5-И. Изучение обменных реакций. Поскольку обменные реакции приводят к образованию веществ, химически идентичных исходным, традиционный химический анализ не способен установить, проходит ли и, если проходит, то насколько, такая реакция. Однако обмен — или, в более широком смысле, участие—легко поддается изучению с применением радиоактивных изотопов, как показывают два следующих примера.
Пиридоксальфосфат служит кофактором во многих ферментативных реакциях. При применении 3Н-пиридоксальфосфата обнаружено, что 3Н из некоторых положений переходит в воду в виде 3Н20. Связанный с ферментом меченый пиридоксальфосфат можно удалить из воды с помощью гель-проникающей хроматографии (гл. 8), а 3Н в воде можно определить путем прямого
РИС. 5-10.
Сравнение экспериментов, проведенных с использованием и без использования радиоактивности.
Штамм бактерии Е. coli, лизогенный по фагу %, заражали фагом К. Известно, что вводимая ДНК превращается в смесь открытых и ковалентно замкнутых колец, которые легко можно различить, исследуя их седиментацию в градиенте щелочного раствора сахарозы (гл. 11). Изображены две картины седиментации. График А получен при использовании фага, меченного 3Н-тимидином, и на нем изображена только радиоактивная ДНК. Две формы здесь легко различаются. На графике Б изображена зависимость концентрации всей ДНК от градиента, поскольку использовался нерадиоактивный фаг* Так как бактериальная ДНК присутствует в большом избытке, ДНК фага проявляется в виде плохо различимых горбиков, / — ковалентно замкнутые кольца; 2 — открытые кольца.
прибавления воды к сцинтилляционному раствору, способному смешиваться с водой. Обнаружение 3Н в воде указывает на прямое участие пиридоксальфосфата в реакции посредством переноса протона.
ДНК представляет собой двухтяжевой полинуклеотид, связанный водородными связями. Если к ДНК прибавить 3НгО и затем отделять ее через различные промежутки времени методом гель-проникающей хроматографии, в ДНК окажется некоторое количество 3Н. Из кинетики обмена и влияния различных денатурирующих агентов можно заключить, что водородные связи последовательно разрываются и вновь образуются. Это явление называется «дыханием». Аналогичный подход применяют и при определении скорости укладки и развертывания белков (гл. 18).
Пример 5-К. Идентификация активных центров ферментов. Радиоактивные изотопы играют важную роль в идентификации активных центров ферментов, поскольку ферментативные реак-
ции требуют настолько малых концентраций фермента, что необходимы колоссальные объемы (если, конечно, фермент достаточно доступен), чтобы получить необходимое количество вещества для традиционного химического анализа. Приведем простой пример определения числа центров связывания.
Ковалентный характер связывания 1-амино-2-бромэтана с активным центром аминооксидазы плазмы быка можно легко продемонстрировать, если второй атом углерода заменить на 14С. Измерение отношения числа молей связанного 14С к числу молей фермента дает число центров связывания. С помощью гидролиза белка на аминокислоты и идентификации типа химической связи можно идентифицировать место связывания (т. е. аминокислоту). Если известна аминокислотная последовательность изучаемого фермента, гидролиз до пептидов позволяет установить положение аминокислоты в белковой цепи.
