Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 7-2.
Типичный прибор для фильтрова ния с разрежением.
1 — пористая стеклянная пластинки, нл которую помещают фильтр; кольца 2 и 3 сжимают пружинным зажимом.
разрежение
мембранные фильтры из ацетата целлюлозы, найлона и поливинилхлорида для использования в некоторых системах растворителей.
Фильтры из стекловолокна
Фильтры из стекловолокна представляют собой переплетение тонких стеклянных волокон (рис. 7-1,Г). Это переплетение не может быть получено таким тесным, как в случае нитроцеллю-лозных фильтров, поэтому для того, чтобы добиться прочности и способности удерживать частицы малого размера, фильтры из стекловолокна должны быть относительно толстыми — приблизительно 0,25 мм. К достоинствам фильтров из стекловолокна следует отнести очень высокую скорость протока (до 120 мл • мин-1. ¦см~2), большую емкость до засорения, устойчивость практически во всех растворителях, возможность нагревания до высокой температуры для быстрой сушки и низкую стоимость (примерно одна треть стоимости мембранных фильтров на единицу поверхности). К недостаткам можно причислить возможность попадания в фильтрат мелких частиц стекловолокна, ограниченный набор диаметров пор и, поскольку мелкие частицы проникают в относительно толстый фильтр, не всегда возможно их полное удаление.
В следующем разделе будет рассмотрено применение фильтров из нитроцеллюлозы и стекловолокна, а в ряде случаев указано преимущество того или другого типа.
Фильтрация с использованием фильтров из нитроцеллюлозы и стекловолокна
Осветление растворов
В процессе различных химических и биологических операций бывает необходимо удалить определенное вещество из жидкости. Пели его частицы очень малы и их не слишком много, для этой цели можно использовать фильтры из нитроцеллюлозы или стекловолокна, за исключением случая, когда частицы слишком малы, чтобы их можно было отделить на фильтре из стекловолокна. Если при этом в жидкости содержится большое количество обычных частиц, необходимо предварительное фильтрование через фильтр из стекловолокна с большими порами, чтобы избежать засорения (большинство предварителных фильтров изготовлено из стекловолокна из-за его высокой емкости).
Некоторые белки, вирусы и бактериофаги адсорбируются на нитроцеллюлозе, поэтому, если необходимо удалить большие частицы без потери подобных материалов, фильтр следует предварительно обработать. Пропускание через фильтр 0,1%-ного раствора альбумина бычьей сыворотки (АБС) в воде с последующим тщательным отмыванием его буферами с низкой ионной силой обычно приводит к насыщению центров адсорбции и предотвращает связывание других белков. Одноцепочечные полинуклеотиды связываются с фильтрами из нитроцеллюлозы и стекловолокна при средней ионной силе, поэтому их связывание не предотвращается промыванием АБС. Однако при низкой ионной силе эта проблема отпадает.
Если осветляемый раствор предназначен для изучения специальными методами, такими, как ядерный магнитный резонанс, измерение оптической плотности, флуоресценции, оптической активности, пригоден любой тип фильтра. Однако, если предполагается измерять рассеяние света или вязкость, когда необходимы растворы, абсолютно свободные от взвешенных частиц, фильтры из стекловолокна нежелательны, поскольку в фильтрат иногда могут попадать мельчайшие частицы стекла.
Отделение осадков для измерения
радиоактивности
Как было описано в гл. 5, для определения радиоактивности макромолекул почти всегда необходимо предварительно отделить радиоактивные макромолекулы от малых радиоактивных молекул и сконцентрировать образец до небольшого объема, чтобы избежать разбавления сцинтиллятора или добавления воды. Обычно это производят путем осаждения хлорной или трихлор-уксусной кислотой (соляную кислоту можно применять для полинуклеотидов, но она неэффективна для белков). После подкис-ления осадки можно быстро отделить на фильтрах из нитроцеллюлозы или стекловолокна, после чего промыть, используя прибор, показанный на рис. 7-2. Для счета жидкостным сцинтилля-ционным методом следует использовать стекловолокно, поскольку оно приводит к некоторому увеличению эффективности счета и может быть высушено при высокой температуре без обугливания, которое иногда вызывает световое тушение (гл. 5). При использовании счетчиков Гейгера — Мюллера оба типа фильтров эквивалентны.
Замена среды для растущих бактерий
В некоторых экспериментах с растущими бактериями иногда необходимо очень быстро сменить питательную среду, например, когда следует удалить радиоактивное соединение или определен-
ный компонент среды. Для этой цели прекрасно подходит мембранная фильтрация. При этом следует учитывать два обстоятельства: 1) нитроцеллюлозные фильтры содержат глицерин, который должен быть отмыт перед использованием ( иначе он может попасть во вторую среду при смывании клеток), и 2) многие бактерии адсорбируются на нитроцеллюлозе (приблизительно 2*106 клеток/см2), что препятствует количественному переносу при низкой плотности клеток (обычно это предотвращается обработкой фильтра 0,1% АБС — приблизительно 0,25 мл/см2 — перед отделением клеток). После фильтрации клетки удаляются с фильтра смыванием питательным раствором или погружением фильтра в среду при осторожном перемешивании. Хотя эта методика чаще всего применяется для бактерий с использованием нитроцеллюлозных фильтров, недавно она стала применяться и для клеток животных с использованием фильтров из стекловолокна.
