Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 6-12.
Электронная микрофотография авторадиограммы бактерии Е. coli, меченной 3Н-тимидином.
Обратите внимание, что при электронной микроскопии зерна выглядят скорее как нити серебра, а не как точки. (Любезно предоставил Люсьен Каро.)
цикл репликации. Интенсивность введения метки увеличивалась к концу этого цикла репликации и оставалась на этом высоком уровне в течение времени, необходимого для инициации следующего цикла репликации. При таком подходе хуже метятся те части хромосомы, репликация которых происходит в начале и в конце цикла репликации. Если репликация идет по двум направлениям, эти две меченые области должны быть расположены симметрично на противоположных сторонах хромосомы, как в данном случае [Rodriguez R. L., Dalbey М. S., Davern С. !., J. Mol. Biol., 74, 599—604 (1973)]. В — другой способ наблюдения области репликации молекулы ДНК. Нерадиоактивную культуру Е. coli выращивали в течение 10 мин в среде, содержащей 3Н-тимидин с низкой удельной радиоактивностью, а затем в течение 5 мин в среде с высокой удельной радиоактивностью 3Н-тимидина. Затем ДНК выделяли и подготавливали для авторадиографии методом, приводящим к вытягиванию. Вследствие вытягивания наблюдаемая картина является результатом суперпозиции двух цепей ДНК. Интерпретация картины показана на схеме под авторадиограммой. Тот факт, что область с низкой плотностью зерен ограничена с двух сторон двумя областями с высокой плотностью, также свидетельствует о репликации по двум направлениям [Rodzl-gttez R., Davern С. L, J. Bacteriol., in press].
J — высокорадиоактивная область; 2 — низкорадиоактивная область.
Список литературы
Caro L,t Van Tubergen R, P., High Resolution Autoradiography, J. Cell. Biol., 15. 179—188 (1962).
Использование электронной микроскопии в авторадиографии.
Gabran Р, B.t Autoradiography for Biologists, Academic Press, 1972.
Gude W. D.y Autoradiographic Techniques: Localization of Radioisotopes in Biological Material, Prentice-Hall, 1968.
Levinthal СThomas C. A, Molecular Autoradiography: The P-ray Counting from Single Virus Particles and DNA Molecules in Nuclear Emulsion, Biochim. Biophys. Acta, 22, 453—465 (1957).
Задачи
6-1, После прикрепления к бактерии фаг вводит в нее всю свою ДНК. Еслет фаг облучить рентгеновскими лучами, он теряет жизнеспособность. Известно, что рентгеновские лучи вызывают двухнитевые разрывы в ДНК. Разработайте авторадиографическую методику, позволяющую определить, вводит ли облученный фаг всю свою ДНК или только ее фрагмент.
6-2. Фаг метили так, что он содержал 42 атома а2Р (в среднем) на фаг. Эффективность определения 32Р с помощью авторадиографии в толстой пленке равна 94%* Сколько дней необходимо экспонировать пленку, чтобы получить в среднем 12 лучей на звезду?
6-3. Предположим вы подозреваете, что большая клетка (диаметром 50 мкм) включает некое соединение только в клеточную стенку, а другие исследователи утверждают, что включение происходит только в цитоплазму. Можно ли эти две альтернативы различить с помощью авторадиографии и как?
6-4. Известно, что штамм Е. coli имеет четыре полные хромосомы, если он растет на определенной богатой среде. Как это можно установить с использованием авторадиографии? (Укажем, что клетку можно оставить делиться с образованием микроколонии на агаре, где будет присутствовать только несколько сот клеток.)
6-5. Вы хотите идентифицировать радиоактивные пятна на хроматограмме на бумаге путем контакта с рентгеновской пленкой. В вашем распоряжении имеются аН и 14С. Какой изотоп вы будете использовать и почему?
6-6. Мутантная бактерия обладает свойством синтезировать белок при 42°С со скоростью, составляющей Vio от скорости синтеза при 37°С. Разработайте авторадиографический эксперимент, чтобы определить, все ли бактерии в популяции обладают таким свойством или внутри популяции существуют фракции с нормальными и аномальными свойствами. Укажите, какие биохимические препараты, изотопы и эмульсию вы будете использовать. Почему будет необходимо различное время экспонирования для контрольной и мутантной популяции?
6-7. Странный мутант Е. coli обладает свойством асимметрического деления с образованием нормальной клетки и аномальной, составляющей Vio объема нормальной с исключительно высокой частотой. Маленькие клетки никогда далее не делятся. Как можно определить, обладают ли они нормальным количеством ДНК или РНК?
6-8. Нуклеоли являются плотными телами в ядрах многих клеток эукариотов; в клетках животных .их диаметр составляет 7ю размера ядра. Можно* ли с помощью авторадиографии определить, содержат ли они ДНК? Объясните.
6-9. Клетки мужских штаммов Е, coli образуют пары с клетками женских штаммов с переносом ДНК от мужских к женским с образованием генетических рекомбинантов (т. е. женских клеток, которые теряют собственные гены с заменой их генами мужских клеток). Генетические тесты показывают, что рекомбинанты не образуются при смешении мужских клеток с мужскими или женских с женскими. Это может происходить либо в результате отсутствия однополового спаривания, либо при отсутствии переноса. Разработайте авторадиографический эксперимент, позволяющий установить существование спаривания клеток одного пола.
