Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
ляющийся предшественником ДНК, и аминокислоту лейцин, 3H-dT включается в ДНК в процессе репликации. Если из среды удалить лейцин, включение 3H-dT будет продолжаться в течение роста одного поколения клеток, а затем прекратится. Количество ДНК, синтезированное за период лейцинового голодания, точно соответствует рассчитанному для популяции, в которой все клетки участвовали в полном репликативном синтезе ДНК, если только репликация молекулы уже началась, но не реинициировали синтеза. Однако для подтверждения такой интерпретации необходимо показать, что распределение включения метки на клетку согласуется с предположенным распределением индивидуальных клеток по возрасту, поскольку существует возможность, что такое распределение может быть достаточно разнообразным — например, большинство клеток может не синтезировать ДНК, тогда как оставшиеся немногие клетки производят более чем одну копию и совпадение может оказаться случайным.
Для проверки этого культуру бактерии разделяли на две части. Одну выращивали в среде, содержащей 3H-dT и лейцин на протяжении многих поколений; другую выращивали с нерадиоактивными тимидином и лейцином в течение многих поколений, а затем заменяли среду на содержащую H3-dT, но без лейцина, и продолжали культивирование до прекращения включения 3H-dT. Разбавленные аликвоты каждой культуры наносили на предметные стекла микроскопа, высушивали и подготавливали для авторадиографии методом погружения. После экспонирования в течение нескольких дней и проявления пластинки с клетками и эмульсией погружали в раствор клеточного красителя, чтобы сделать бактерию видимой под микроскопом. На рис. 6-8 показана окрашенная клетка с зернами 3Н. Количество клеток с 0, 1, 2, 3,... зернами сводят в таблицу. Первая культура давала данные по распределению зерен на клетку, характерному для полного комплементарного синтеза ДНК. Вторая культура давала данные о количестве ДНК, синтезированной в каждой клетке только за
время лейцинового голодания. Статистический анализ распределения, полученный для этой культуры, соответствовал приведенной выше интерпретации. Этот эксперимент подтвердил важную гипотезу, согласно которой для инициации синтеза ДНК необходим синтез белка.
Метод покрывающей пленки
Покрывающая пленка состоит из слоя ядерной эмульсии толщиной 5 мкм на подложке из желатины толщиной 10 мкм, нанесенной на стеклянную пластинку. Ее можно отделить от стекла скальпелем. Метод состоит в том, что пленку помещают эмульсией на поверхность воды, выдерживают 2—3 мин, после чего ее площадь становится равной 140% от первоначальной. Стеклянную пластинку с образцом вводят под плавающую на воде пленку и поднимают таким образом, чтобы пленка облегала ее. После высушивания пленка уменьшается в размере и плотно обтягивает пластинку (рис. 6-2). Как эмульсия, так и желатина остаются в тесном контакте с образцом в течение экспонирования, проявления и наблюдения с помощью микроскопа. После проявления образец обычно окрашивают, чтобы сделать его видимым.
Покрывающая пленка очень удобна в работе и дает высокое разрешение в пределах от 0,5 до 5,0 мкм. Толщина эмульсии здесь более равномерна, чем в других методах, что позволяет на основании счета зерен проводить достаточно точное сравнение радиоактивности различных структур или частей клеток. Однако метод имеет и некоторые недостатки: эмульсия здесь менее чувствительна, чем в других вариантах; если покрывание проводится при низкой влажности, происходит наведение статического заряда, вызывающего увеличение фона; сама процедура требует большего времени, чем метод погружения. Метод находит достаточно широкое применение в авторадиографии, хотя некоторые специалисты считают, что метод погружения обладает всеми его преимуществами плюс быстрота. Вообще можно считать, что выбор между двумя методами — погружения и покрывающей пленки — дело вкуса.
С помощью метода покрывающей пленки был проведен один из классических экспериментов в молекулярной биологии.
Пример 6-В. Демонстрация числа сохраняющихся субъединиц хромосом. В 1957 г. Мэтью Мезельсон и Франклин Шталь показали, что ДНК реплицируется с частичным сохранением (гл. 11, пример 11-К); таким образом, каждый тяж служит матрицей для репликации другого, так что два первоначальных тяжа разделяются на отдельные дочерние двойные спирали. Хромосомы клеток корней бобов Vicia faba можно пометить 3Н-тимидином, выращивая их продолжительное время в среде, содержащей 3H-d7\ Авто-
РИС. 6-9.
Авторадиограммы, показывающие хромосомы Vicia faba при первом (Л) и втором (Б) делениях после мечения 3Н-тимидином в течение одной синтетической фазы.
А — метку включают обе родственные хроматиды; Б — меченой оказывается только одна из каждой пары. Отметим, что самая верхняя из них с Х-образной конфигурацией оказывается меченой в обеих верхних ветвях, но соответственно далеко и близко от центральной точки пересечения. Это является примером родственного обмена в хроматидах (Taylor /. Herbert, Molecular Genetics, part-1, Academic Press, 1963). (Авторадиограммы любезно предоставил Дж. Герберт Тейлор.)
