Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Нитроцеллюлозные фильтры и анализ связывания
Нитроцеллюлозные фильтры в определенных условиях способны связывать белки и одноцепочечные ДНК. Такое связывание может найти применение для большого числа ферментативных и физико-химических анализов, а также в качестве метода очистки различных препаратов. Связывающие свойства двух коммерческих нитроцеллюлозных фильтров представлены в табл. 7-1. Следует заметить, что связывание белков не зависит от ионной силы, однако одноцепочечные ДНК прочно удерживаются такими фильтрами только при относительно высокой ионной силе. Плохое связывание одноцепочечных ДНК с фильтром Millipore необъяснимо, хотя, может быть, оно обусловлено тем, что эти фильтры изготовлены не из чистой нитроцеллюлозы, РНК не связываются с этими фильтрами.
Связывающие свойства фильтров лучше всего демонстрируются приведенными ниже примерами.
Пример 7-А. Очистка ковалентно замкнутой кольцевой ДНК. Некоторые штаммы бактерий и ряд клеток животных содержат ковалентно замкнутую кольцевую двухцепочечную ДНК, поли-яуклеотидные цепи которой не содержат разрывов (гл. 1). Такая ДНК часто присутствует только в виде небольшой части общей ДНК. Если ДНК обработать щелочью, водородные связи разрушатся и образуются однотяжевые цепи; однако в случае, когда ДНК представляет собой ковалентно замкнутые кольца, цепи остаются физически связанными. После нейтрализации раствора
ТАБЛИЦА 7-1
Связывание различных веществ с нитроцеллюлозными фильтрами3
Фильтры
Вещество Schleicher MilHpore Ионная сила^
and Schuell
Белки + + 0,01---1,0
Одноцепочечная ДНК + Плохо 0,15
--- --- 0,01
Двухцепочечная ДНК --- --- >0,05
+ в + в 0,001---0,005
Одноцепочечная РНК 0,01---1,0
Комплекс белка с двухцепочеч + + 0,01---1,0
ной днк
а Некоторые данные были предоставлены доктором А. Брауном. ® Влияние ионной силы проверяли только в указанных пределах. 8 Связывание неэффективно.
ДНК и инкубировании его при несколько повышенной температуре структуры ковалентно замкнутых колец быстро восстанавливаются. Единичные цепи, образованные из линейных ДНК, также будут в конце концов восстанавливать двухтяжевую структуру ДНК, но этот процесс очень медленный и к тому же зависит от концентрации ДНК. Кольцевые молекулы ДНК, содержащие один разрыв в одной из цепей, будут разделяться с образованием линейной и кольцевой цепей; восстановление двухтяжевого кольца требует тех же условий, что и для восстановления линейной ДНК. Если ДНК после щелочной обработки пропустить через фильтр фирмы Schleicher and Schuell при высокой ионной силе (табл. 7-1), через фильтр будут проходить только двухцепочечные ковалентно замкнутые кольца (поскольку все остальные компоненты представляют собой отдельные цепи, которые связываются с фильтром) и таким образом они будут очищены (рис. 7-3). Подобную операцию с большими количествами ДНК проводят на колонках с порошкообразной нитроцеллюлозой.
Пример 7-Б. Анализ информационной РНК. При пропускании через фильтр раствора одноцепочечной ДНК с последующей его сушкой в вакууме можно получить фильтр, содержащий связанную одноцепочечную ДНК. Эта ДНК остается связанной даже при погружении фильтра в воду. Если радиоактивную РНК и фильтр поместить в небольшой сосуд при ренатурирующих условиях, приводящих к образованию связанного водородными свя-
РИС. 7-3.
Схема очистки ковалентно замкнутых двухцепочечных кольцевых ДНК на ннтроцеллюлозных фильтрах.
Образец ДНК денатурируют обработкой щелочью. Затем pH доводят до значения, при котором быстро ренатурируют ковалентно замкнутые двухцепочечные кольца, но линейные цепи ренатурируют медленно. Смесь фильтруют. Двухцепочечные кольца проходят через фильтр, а единичные линейные цепи задерживаются на поверхности фильтра. Таким образом получают очищенную фракцию кольцевых двухцепочечных ДНК. / — ковалентно замкнутые двухцепочечные кольца; 2 — линейная двухцепочечная ДНК; 3 — денатурированные ковалентно замкнутые кольцевые ДНК; 4 — денатурированные (одноцепочечная) линейная ДНК; 5 — денатурированные цепи остаются на фильтре; 6 — очищенные кольцевые ДНК.
зями комплементарного гибрида ДНК — РНК (гл. 1), и затем фильтр поместить в прибор с разрежением и отмыть, большая часть несвязанной РНК будет смыта с фильтра (рис. 7-4). При обработке ферментом панкреатической рибонуклеазой (которая гидролизует одноцепочечную РНК, но не действует на РНК, участвующую в образовании двухцепочечной структуры) разрушается оставшаяся неспаренная РНК. Затем фильтр тщательно промывают, после чего остается только специфически связанная (гиб-ридизованная) РНК, которую можно определить по радиоактив* ности.
