Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
А Б
РИС. 7-6.
Диализ.
Только маленькие молекулы (точки) проходят сквозь целлофановую мембрану. В равновесии концентрация маленьких молекул одинакова по обе стороны мембраны. Макромолекулы остаются в мешке. А — начало диализа; Б — равновесие. 1 — целлофановый мешок; 2 — концентрированный раствор; 3 — буфер.
РИС. 7-7.
Обратный диализ.
А — раствор макромолекул (4 макромолекулы, О растворитель) помещают в диализный мешок, который покрывают порошком сухого полиэтиленгликоля (ПЭГ); 5 — молекулы растворителя выходят из мешка и проникают в ПЭГ. Ни ПЭГ, ни макромолекулы не могут проникнуть сквозь мембрану, таким образом раствор концентрируется. 1 — мешок для диализа; 2 — зажимы; 3— порошок полиэтиленгликоля.
этот мешок погружают в большой резервуар с подходящим буфером (рис. 7-6). Маленькие молекулы из раствора (за исключением сильно заряженных) свободно проходят через мембрану до тех пор, пока не установится равновесие*. Чтобы добиться желаемого состава раствора внутри мешка, внешняя жидкость должна периодически меняться до достижения конечного состава. Вода также свободно проходит сквозь мешок, что приводит к концентрированию или разбавлению в зависимости от того, какой раствор более концентрированный — внутренний или внешний (осмотический эффект).
Вариант, называемый обратным диализом (рис. 7-7), может быть использован для концентрирования вещества внутри мешка. Закрытый мешок помещают в сухой водорастворимый полимер, который не может проникнуть сквозь мембрану, например поли-этиленгликоль. Затем вода выходит из мешка, растворяя внешний сухой полимер. С этой целью может быть использована также сахароза, но при удалении воды она будет проникать в мешок, так как легко диализуется.
* Здесь под равновесием подразумевается равенство концентраций внутри и снаружи мешка.
1
РИС. 7-8.
Устройство для молекулярной фильтрации.
Раствор, содержащий большие и маленькие макромолекулы, продавливают через моле* кулярную мембрану. Молекулы, размеры которых превышают допустимые, не проходят сквозь мембрану, тогда как растворитель и маленькие молекулы свободно проникают через нее. Вращающийся магнит служит для предотвращения засорения мембраны. Таким способом можно очищать как большие, так и маленькие молекулы. Большие молекулы могут быть этим способом сконцентрированы, / — давление воздуха; 2— большие макромолекулы; 3 — маленькие макромолекулы; 4 — растворитель; 5—вращающийся магнит; 6 — мембрана; 7 •—магнитная мешалка; 8 — растворитель + маленькие макромолекулы.
Полупроницаемые мембраны, которые пропускают малые молекулы, но задерживают большие, изготовляются рядом фирм. В качестве примера можно привести трубки Spectropor (Spectrum Medical Industries, Inc.), которые используются так же, как любая другая пленка для диализа. Они выпускаются трех типов с порами, пропускающими вещества с молекулярной массой от 6000 до 14 000.
Важной модификацией приспособлений для диализа служат мембраны Diaflo (Amicon Corporation) или Pellicon (Millipore Corporation). Они представляют собой очень тонкие (0,1 —
РИС. 7-9.
А — действие полых волокон. Волокно первоначально погружают в раствор с большими и маленькими молекулами. Маленькие молекулы проходят через поры волокна во внутренний канал и уносятся потоком воды. Большие молекулы не могут пройти сквозь поры. (Любезно предоставлено Bio-Rad Laboratories.) Б— электронная микрофотография полого волокна. (С разрешения Amicon Corporation.)
1,0 мкм) полимерные мембраны с размером пор от 2 до 100 А, укрепленные на более толстом (50—250 мкм) поддерживающем слое с губчатой структурой. Диапазон молекулярных масс пропускаемых молекул варьирует в пределах от 500 до 100 000. Такие мембраны используют для концентрирования (для этого берут мембраны, пропускающие только воду), обессоливания при подготовке образцов для хроматографии и фракционирования по молекулярной массе. Скорость потока через эти мембраны настолько мала, что работать с иими можно только под давлением. Для их использования обычно требуются специальные держатели (рис. 7-8). Такие устройства выпускаются в различных модификациях, позволяющих работать с большими или малыми объемами или с несколькими образцами.
Диализ через полые стеклянные волокна
Полупроницаемые стеклянные волокна служат полезными устройствами как для диализа, так и для концентрирования. Они представляют собой пустотелые волокна, стеклянные стенки которых обладают порами с контролируемым размером. Молекулы, размер которых меньше размера пор, свободно проходят через стенки волокон (рис. 7-9, Л). Эти волокна обычно используют в виде пучков, что позволяет получить очень большую площадь поверхности. Пучки, как правило, изготовляют в виде блоков, один из типов которых изображен на рис. 7-10. Чтобы сменить буфер в образце, содержащем макромолекулы, на другой буфер, образец помещают в сосуд, а через волокна пропускают большой объем второго буфера (рис. 7-10, А). Маленькие молекулы двух буферов быстро обмениваются через поры волокон; поскольку буфер, протекающий по волокнам, находится в избытке, первый буфер заменяется вторым. Макромолекулы при этом не могут проникнуть в поры и остаются снаружи. Если требуется провести обес-соливание, то через волокна пропускают воду. Для концентрирования растворов используют установку, изображенную на рис. 7-10, Б. Здесь раствор также помещают в сосуд, волокна присоединяют к вакууму. Разность давлений перемещает растворитель и растворенное вещество к волокнам, при этом происходит концентрирование раствора. Возможны и другие приемы для пропускания растворов через волокна, однако они используются редко, что связано с быстрым засорением волокон.
