Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Если отмытый фильтр затем нагреть до температуры выше температуры плавления гибрида ДНК — РНК (гл. 1), специфически связанная РНК будет освобождаться; этот метод является наилучшим для очистки специфической информационной РНК.
РНК
нигороцеллюлозы в раствор РНК
ренатурация с комплементарной РНК
1
РИС. 7-4.
Метод гибридизации РНК с нитроцеллюлозными фильтрами, содержащими связанную одноцепочечную ДНК.
Пример 7-В. Анализ комплементарности одноцепочечных ДНК. Фильтры, содержащие нерадиоактивную связанную одноцепочечную ДНК, приготовленные, как в примере 7-Б, можно использовать для анализа комплементарности одноцепочечной ДНК. Однако при добавлении к таким фильтрам радиоактивной одноцепочечной ДНК естественно будет происходить связывание, независимо от того, имеется ли на фильтре или нет предварительно связанная с ним ДНК (табл. 7-1). Тем не менее, если промыть фильтр, уже содержащий нерадиоактивную ДНК, АБС и поливинилпирролидоном, свободные места связывания одноцепочечной ДНК будут блокированы, т. е. радиоактивная одноцепочечная ДНК не сможет связываться по ним. При погружении предварительно обработанного таким образом фильтра в раствор, содержащий радиоактивную ДНК, в условиях, способствующих гибридизации, как в примере 7-Б, комплементарная радиоактивная ДНК будет ренатурировать с предварительно связанной ДНК. Несвязавшаяся ДНК может быть затем отмыта, что даст возможность определить связанную радиоактивность. Такой метод можно использовать для идентификации некоторых видов ДНК. Например, если бактерию Е.соЫ инфицировать фагом К и инкубировать затем в среде, содержащей 3Н-тимидин, будут синтезироваться ДНК как E.coli, так и фага К. Если затем радиоактивную ДНК превратить в одноцепочечную ДНК (с помощью термической или щелочной денатурации) и ренатурировать на фильтре, с которым связана ДНК Е. coli или фага Я, относительное количество радиоактивности, связывающееся на фильтре в каждом случае, будет указывать долю каждой ДНК в начальной радиоактивной смеси.
б*
?>елок
Vb- -
с ДНК *
фильтрация
РИС. 7-6.
Анализ ДНК, связывающейся с белком, с помощью адсорбции на фильтре.
Образец содержит белок (черные точки) и два типа ДНК. Белок связывается с ДИК, обозначенной черными линиями, но не связывается с ДНК, обозначенной тонкими линиями. При фильтрации через нитроцеллюлозу весь белок связывается. Молекулы ДНК, связавшиеся с белком, остаются на фильтре. Все другие молекулы проходят сквозь фильтр. Количество адсорбированной радиоактивной ДНК может служить мерой количества связанного белка. 1 — ДНК, связанная с белком; 2 — несвязанная ДНК остается в фильтрате.
Пример 7-Г. Анализ белков связывающихся с двухцепочечной ДНК. Если смесь белков инкубировать в обычных условиях с радиоактивной двухцепочечной ДНК, образуется некоторое количество комплексов ДНК — белок, в которых участвуют белки, специфически связывающиеся с ДНК (рис. 7-5). Поскольку белок связывается с фильтром, любая радиоактивная ДНК образует комплекс с белком на фильтре. Такой анализ лучше делать на фильтрах фирмы Millipore, так как для них фон, обусловленный несвязанной ДНК, очень мал (табл. 7-1). Этот простой метод используется при очистке белков-репрессоров, поскольку их можно определить только по способности связываться со специфическими центрами двухцепочечной ДНК. Такой прием находит применение также при определении интермедиатов ДНК — фермент в некоторых реакциях и для измерения числа центров связывания данного белка (например, РНК-полимеразы) с молекулой ДНК.
Различные приложения мембранных фильтров
Мембранные фильтры могут служить также в качестве иммобилизующего агента. Например, при скрещивании переносящих хромосомы мужских (Hfr) штаммов Е. coli и женских реципиент* ных штаммов спаривающиеся клетки отрываются друг от друга из-за броуновского движения. При выведении бактериальных
штаммов с особыми свойствами часто бывает необходимо перенести ген. Этот процесс обычно идет в направлении от мужской клетки к женской и требует значительного времени спаривания. Однако такой перенос гена часто прерывается по причине, указанной выше. Если женские клетки будут отделены на мембранном фильтре, а затем мужские будут фильтроваться через них, скрещивание протекает нормально в том случае, когда фильтр помещен на поверхность питательной среды на агаре. Поскольку при этом клетки иммобилизованы, нарушение спаривания незначительно, и частота переноса гена существенно возрастает. После окончания периода скрещивания клетки можно отмыть с фильтра и перенести на обычные агаровые пластинки.
Диализ и молекулярная фильтрация
Обычное фильтрование отделяет частицы от жидкости при пропускании суспензии через пористый материал. Однако так называемые полупроницаемые мембраны позволяют разделить растворенные молекулы по их величине.
Наиболее известным методом является диализ, при котором водный раствор, содержащий одновременно макромолекулы и очень маленькие молекулы, помещают в целлофановый мешок и
