Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
2) очень маленькие молекулы (например, аминокислоты и пурины) проникают в бумагу и становятся недоступными для растворителя.
Серьезным улучшением методики является отделение тонких осадков на мембранных фильтрах из нитроцеллюлозы (например, Millipore, Schleicher and Schuell и Gelman) или, что даже лучше, на бумагах из стекловолокна, как описано в гл. 7. Вероятно, этот метод является наиболее распространенным для приготовления образцов в современной биохимии, поскольку он быстр и удобен, хотя и не устраняет возможности самопоглоще-ния, особенно в том случае, когда концентрация вещества превышает 1 мг/см2. Подробно метод будет обсуждаться в следующем разделе. Применение нитроцеллюлозных фильтров имеет специфические особенности. После того как образец отделен, фильтр обычно сушат при 100°С для удаления следов воды с тем, чтобы предотвратить химическое тушение. Иногда при этом возникает желтая окраска или обугливание, вызываемое нагреванием. Окрашенный материал переходит в сцинтилляционный раствор и поглощает фотоны, испускаемые флуоресцентом в синефиолетовой области. В ряде случаев возникновение желтой окраски происходит неожиданно и часто вызывает потерю воспроизводимости при работе с одними и теми же образцами.
Наиболее эффективными средствами предотвращения возникновения окраски служат либо промывание образца органическим растворителем для быстрой сушки, либо понижение температуры сушки до 80°С. Возможность возникновения окраски подложки исключается при замене нитроцеллюлозных фильтров фильтрами из стекловолокна. Стекловолокно имеет также то преимущество, что по неизвестным причинам оно приводит к повышению эффективности счета в сцинтилляторах на основе толуола и, как отмечалось выше, снимает проблему светового тушения за счет появления окраски при высокотемпературной сушке.
Определение эффективности счета с помощью анализа амплитуды импульсов
Если требуется определить абсолютное число распадов, необходимо знать эффективность счета. Отметим, что в большинстве экспериментов этого обычно не требуется. Наиболее часто встречается ситуация, когда сравнивают радиоактивность нескольких образцов; при этом достаточно быть уверенным, что эффективность счета одна и та же для всех образцов. Это соблюдается не всегда, так как образцы могут иметь различный химический состав, что часто приводит к различным уровням химического тушения, светового тушения или тушения за счет разбавления. Более того, зачастую приходится сравнивать растворимый образец с нерастворимым или два нерастворимых образца с различными физическими свойствами.
Обычно приходится иметь дело с химическим тушением. Наиболее распространенными методами для определения степени тушения служат методы отношения каналов, внешней стандартизации и внутренней стандартизации. В основе двух первых методов лежит тот факт, что тушение понижает эффективность счета из-за сдвига спектра в область более низких энергий (рис. 5-7, Л); лри этом счет уменьшается вследствие того, что большая часть распадов не может быть зарегистрирована счетчиком, так как они становятся как бы однофотонными и отбрасываются схемой совпадений, или энергия импульсов становится ниже уровня L1, необходимого для понижения шума фотоумножителя. Заметим, однако, что сравнивая спектры с тушением и без тушения между двумя парами уровней LI—HL2 и L2—*L3, можно увидеть, что тушение вызывает относительное увеличение числа отсчетов в канале А по сравнению с каналом Б (т. е. изменяется соотношение счета в каналах), хотя общее количество отсчетов понижается. Следовательно, метод отношения каналов заключается в при-
готовлении набора стандартов с различными уровнями тушения (например, с помощью добавления таких тушителей, как вода или хлороформ) и построении кривой зависимости числа регистрируемых импульсов от отношения числа зарегистрированных импульсов в каналах А и Б (рис. 5-7, Б). Таким образом, для образца, в котором ожидают тушение, счет производится в той же паре каналов, что и для стандарта, рассчитывают отношение и процент тушения определяют по кривой, приведенной на рис. 5-7,5. Например, если для некоторого образца измерена радиоактивность в 500 имп/мин, а измеренная методом отношения каналов эффективность счета составляет 20%, радиоактивность образца без тушения составляет 500/0,20 = 2500 имп/мин.
В методе внешней стандартизации необходимо использование источника радиоактивности (обычно I37Cs), помещаемого вне флакона, но внутри счетчика и облучающего образец у-лучами. При прохождении у-лучей через 'растворитель образуется некоторое количество электронов, которые регистрируют тем же способом, что и (3-частицы. В образце с тушением энергетический спектр этих электронов также сдвигается, в 'результате чего может быть установлена зависимость эффективности счета от отношения счета в каналах (рис. 5-7,В). Преимущество метода внешней стандартизации перед методом отношения каналов состоит в том, что у-источник обеспечивает очень высокую скорость счета (~105 имп/мин) и поэтому большую статистическую достоверность (вспомните правило Nиз примера 5-А). Этот метод особенно ценен, если радиоактивность исследуемого образца слишком мала для применения метода отношения каналов.
