Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Пример 2-Е. Получение изображения нуклеиновых кислот в клетках животных и растений. Акридиновый оранжевый связывается как с ДНК, так и с РНК, однако с ДНК имеет место зеленая флуоресценция, а при высокой концентрации с РНК — оранжевая флуоресценция (рис. 2-19). Таким образом, при низкой концентрации красителя в клетках эукариотов видны ярко-зеленые ядра и бледно-зеленая цитоплазма; при высоких концентрациях красителя цитоплазма становится оранжевой. При митозе хромосомы выглядят ярко-зелеными; это помогает получить их морфологические характеристики непосредственно в оюи-вой клетке. Если клетка инфицирована ДНК-вирусом, то можно обнаружить включения вирусов в виде ярко-зеленых пятен в цитоплазме и даже сосчитать их.
РИС 2-19.
Микрофотографии клеток пекарских дрожжей, находящихся в периоде покоя.
А— фазово-контрастный микроскоп; Б — флуоресцентный микроскоп. Обратите внимание на отсутствие некоторых деталей и яркий ореол вокруг клеток на снимке А. На спим-ке Б к клеткам был добавлен акридиновый оранжевый, в результате чего ядра становятся ярко-зелеными (N) и их легко можно отличить от цитоплазмы (С), содержащей РНК, которая становится оранжевой, и вакуоли (V), не содержащей нуклеиновых кислот и поэтому не флуоресцирующей.
Пример 2-Ж. Наблюдение мелких органелл. Ядра дрожжевых клеток очень трудно увидать из-за их малого размера. Если же прибавить акридиновый оранжевый в незначительной концентрации, то на внешней стороне вакуоли будет виден ярко-зеленый полярный объект (рис. 2-19). При более высокой концентрации вакуоль останется бесцветной, ядра станут еще более яркими, а цитоплазма приобретет оранжевую окраску. Этим методом было впервые показано, что дрожжи содержат ДНК, так как для дрожжей характерно настолько большое отношение РНК/ДНК, что до начала 50-х годов химическими методами не удавалось обнаружить в них ДНК.
Пример 2-3. Метод флуоресцентного антитела. С антителами, полученными против частей клеток или белков, может ковалентно связываться флуоресцеин (рис. 2-20). Прибавление такого флуоресцентного антитела к тонким срезам тканей или к клеткам, которые в результате обработки кислотой или ацетоном стали проницаемыми для белка, позволяет локализовать эти вещества. Например, вирусные антигены, компоненты клеточных мембран, гистоны и многие другие вещества можно локализовать этим методом в отдельных клетках или тканях. Белки мышечных волокон, актин и миозин, можно надежно различить при использовании антиактина и антимиозина со связанным флуоресцеином.
Пример 2-И. Поляризационно-флуоресцентная микроскопия. Известно, что акридиновый оранжевый способен интеркалиро-вать между парами оснований ДНК. Плоскость поляризации флуоресценции акридинового оранжевого известна, а отсюда известен и угол поляризации флуоресценции относительно оси спирали ДНК. Акридиновый оранжевый прочно связывается с хромосомами, как полагают, за счет связывания с ДНК. Поэтому поляризация флуоресценции хромосом дает возможность установить ориентацию молекулы ДНК относительно хромосомы.
Пример 2-К. Идентификация хромосом по флуоресценции хинакрина. Хинакрин может связываться с ДНК как в растворе, так и в хромосомах. Еще более эффективно связывается со свободными аминогруппами нуклеотидов ДНК хинакриновый иприт. При прибавлении его к клеткам хромосомы не только флуоресцируют, но также обнаруживают характерное сочетание темных и светлых зон. Причина образования таких зон не ясна; возможно, это связано с более сильным связыванием хинакрина с участками, где имеется большее содержание пар оснований аде-нин — тимин, и с участками, с которыми преимущественно связываются некоторые гистоны. Ценность этого метода состоит в том, что он позволяет по сочетанию зон различить хромосомы, которые морфологически различаются лишь с большим трудом. Кро-
РИС. 2-20.
Пример использования флуоресцентной микроскопии.
Изображен поперечный срез лимфатического узла кролика, клетки которого содержат антитело против альбумина бычьей сыворотки (АБС) на четвертый день после повторной иммунизации. Многие клетки дают желто-зеленую флуоресценцию флуоресцеина (па рисунке белые}, тогда как фон из других клеток выглядит голубоватым (на рисунке серый). Антитело находится в цитоплазме. Ткань фиксировали 95%-ным этанолом при 4°С в течение ночи, затем обезвоживали в холодном 100%-ном этаноле, осветляли в холодном ксилоле и погружали в парафин при температуре ниже С0°С. Затем делали срез, депарафинировали его и гидратировали. Далее срез обрабатывали АБС (0,5 мг/мл в физиологическом растворе) и промывали. В результате АБС связывается только с участками, содержащими антитело, а несвязанный АБС удаляется при промывке. Анти-АБС метили флуоресцеином (две молекулы на молекулу белка) и наносили тонким слоем па срез, чтобы могла пройти реакция с любым связанным АБС. При этом обнаруживается антитело, которое находилось в клетках с самого начала. Таким способом было показано. что клетки лимфатических узлов синтезируют анти-АБС. (Любезно предоставил Альберт Коонс.)
