Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 3-2.
1 Держатель образца или
\ 2 сетка, которая состоит
\ обычно из тонкой медной
сетки, покрытой тонкой / пленкой пластика или
3 углерода (пленка-под-
ложка ). Образец удерживается пленкой-подложкой.
^ А — вид сверху; Б — вид
сбоку. 1 — пленка-подложка; 2 — образец; 3 — металлическая сетка.
толщина ее должна быть равномерной и не иметь явной структуры при большом увеличении.
Подложка образца, или сетка (рис. 3-2), для всех образцов представляет собой медный диск (в некоторых случаях платиновый) с отверстиями размером приблизительно 75 мкм, покрытый тонкой «прозрачной для электронов» пленкой, называемой пленкой-подложкой *. Прозрачность для электронов означает низкую и одновременно равномерную способность к рассеянию электронов. Наиболее часто применяемые пленки представляют собой слои толщиной от 100 до 200 А либо углерода, либо различных пластиков (парлодион, формвар). К сожалению, любая пленка-подложка обладает собственной структурой, поэтому при исследовании структур макромолекул, размеры которых сравнимы с толщиной пленки, вариации интенсивности фона приводят к образованию «зерна», причем размеры зерен составляют от 5 до 10 А. Это серьезно ограничивает разрешение. Пленки получают одним из следующих трех способов (рис. 3-3). Для получения пленки из парлодиона каплю раствора парлодиона в амилацетате помещают на поверхность воды. (Поверхность жидкости используется для получения очень ровной пленки.) Капля растекается по поверхности, растворитель испаряется, после чего получается тон-кая пленка пластика. Пленки из формвара получают путем погружения ровного предметного стекла в раствор пластика, после чего стекло извлекают, высушивают и медленно опускают в воду. В результате на поверхности воды остается тонкая формварная пленка. (Такой метод погружения некоторые специалисты предпочитают и для парлодиона.) Углеродные пленки получают напылением на свежерасщепленные пластинки слюды, которые имеют ровную на молекулярном уровне поверхность, так как являются одной плоскостью кристалла, с последующим перенесени-
* Термин «сетка» используется специалистами для обозначения как диска с отверстиями как такового, так и диска, покрытого пленкой-подложкой.
4
РИС. 3-3.
Получение пластиковой пленки-подложки.
В одном варианте на чистую поверхность воды наносят каплю раствора парлодиона в амилацетате. Капля расплывается, растворитель испаряется, после чего остается тонкая1 пленка пластика. В другом варианте предметное сгекло микроскопа покрывают тонкой; пленкой из парлодиона или формвара путем погружения стекла в раствор пластика с концентрацией значительно меньшей, чем используется в капельном методе. В некоторых случаях пленка представляет собой тонкий слой углерода, напыляемого в вакууме-на поверхность стекла или листка слюды. При опускании стекла и воду пленка сходит со стекла и плавает на поверхности воды. Затем на поверхность пленки помещают сетку, а сверху прикладывают кусок фильтровальной бумаги. Если после этого поднять бумагу, то сетка прилипнет к бумаге, В другом способе применяется сосуд с краном в дне. Сетку помещают на подставку, которая сверху покрывается водой. Затем на поверхности; воды получают пленку, открывают кран на дне сосуда и, после того как уровень воды станет ниже сетки, пленка полностью ляжет на сетку, / — медицинская пипетка; 2 — раствор парлодиона в амилацетате; 3 — пленка, полученная при расплывании капли;
4— стеклянная пластинка; 5 — пленка; 6 — сетки.
ем пленки на поверхность воды, как в случае получения пленок из формвара. Затем пленки наносятся на сетку одним из двух способов. Первый состоит в том, что сетку помещают на дно сосуда, заливают водой, на поверхность которой помещают пленку, после чего воду спускают. В другом варианте сетку помещают на пленку сверху (рис. 3-3) и подложку извлекают, прикасаясь к ней листком пластика или фильтровальной бумаги.
Подготовка образцов и увеличение контраста
Собственный контраст биолргических материалов невелик из-за того, что рассеяние электронов луча атомами углерода пленки-подложки имеет тот же порядок, что и рассеяние всех основных атомов образцов (С, N, О, Р, S). Обычно для усиления контраста в структуру вводят атомы тяжелых металлов с высокой рассеивающей способностью, причем таким образом, чтобы получаемая картина каким-либо образом отражала особенности структуры образца. Чаще всего используют осмий, платину, свинец и уран, хотя иногда применяют хром, палладий, вольфрам и золото. Некоторые стандартные методы получения образцов и увеличения контраста будут приведены далее.
Заливка, получение срезов и окрашивание
Если наблюдаемый материал слишком толст для того, чтобы через него могли проходить электроны, необходимо получить из него тонкий срез. Для этого материал должен быть достаточно жестким. Жесткость достигается с помощью процесса, называемого заливкой, который заключается в постепенном замещении воды в образце органическим мономером (например, метилмет-акрилатом), который при полимеризации дает твердый материал. После затвердевания считается, что полимерный блок содержит неразрушенный образец, который затем разрезают с помощью ультрамикротома на слои толщиной от 500 до 1000 А. Эти срезы затем окрашивают (иногда окрашивание проводят перед заливкой), выдерживая их в растворах солей молибдена, вольфрама, свинца или урана, либо в парах тетраокиси осмия. (Термином окрашивание обозначается процесс введения атомов тяжелого металла с помощью химической реакции или в результате образования комплексов с некоторыми компонентами образца для увеличения электронной плотности.) Таким способом атомы тяжелых металлов вводятся в белки, а также в другие макромолекулы и агрегаты, создавая тем самым в образце участки с высокой электронной плотностью. Окрашенные препараты дают прекрасные картины (рис. 3-4) со множеством важных деталей, которые интерпретируются по распределению атомов металлов, т. е. по функциональным группам, с которыми способен реагировать конкретный окрашивающий агент. Следует иметь в виду, что при этом могут возникнуть артефакты. Например, при включении осмия с обратной стороны толстой мембраны на изображении получаются две черные линии, разделенные неокрашенным пространством, что может привести к ошибочному заключению
