Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Одной из важных разновидностей методики Кляйншмидта является гетеродуплексный метод. Он состоит в том, что однотяжевые молекулы различных ДНК подвергают гибридизации (гл. 18). Гомологичные участки (т. е. участки, содержащие комп-
лементарные последовательности оснований) выглядят как двухцепочечная ДНК, тогда как негомологичные участки остаются в виде одноцепочечных петель (рис. 3-16).
Недавно был разработан еще один вариант метода Кляйп-шмидта, в котором цитохром с заменен хлоридом бензалкония — поверхностно-активным веществом, которое также образует пленку, способную прилипать к ДНК. На ДНК напыляют платину, но в связи с тем, что ДНК здесь не покрыта слоем белка, она выглядит гораздо уже, чем с применением цитохрома с. Позитивное контрастирование проводится так же, однако атомы урана связываются непосредственно с ДНК. Эта процедура дает гораздо лучшее разрешение макромолекул (например, РНК-полиме-разы), связанных с ДНК, и, вероятно, этот метод ждет большое будущее (рис. 3-17).
Специальные способы получения изображения
Электронная микроскопия темного поля
Электронная микроскопия темного поля позволяет значительно увеличить контраст, так же как в случае оптического микроскопа. Темное поле можно получить либо путем освещения пучком электронов в виде полого конуса, как в оптической микроскопии (гл. 2), либо направляя пучок электронов на образец под таким углом, чтобы он не попадал в систему получения изображения. В результате изображение получается только за счет рассеяния и дифракции электронов. Электронная микроскопия темного поля используется не слишком широко, однако она заслуживает самого пристального внимания в случае макромолекул. Простой пример демонстрирует возможности метода.
Пример 3-А. Связывание белков с ДНК. ДНК имеет диаметр 20 А, однако после нанесения слоя цитохрома с по методу Кляйншмидта диаметр ее возрастает до приблизительно 200 А. Для наблюдения центра связывания белка с ДНК белок должен иметь размеры более 100 А, в противном случае он будет теряться на фоне цитохрома с, покрывающего ДНК. Однако, если использовать ультратонкие пленки-подложки, несущие электрический заряд, ДНК или ДНК вместе со связанным белком будет выходить из водного раствора без участия поддерживающей белковой пленки. Как ДНК, так и молекула интересующего белка могут быть положительно окрашены уранилацетатом. Однако, хотя пленка-подложка не окрашивается, контраст будет невысоким, поскольку в отсутствие цитохрома с общее количество связанного
РИС. 3-18.
Электронная микрофотография на темном поле ДНК фага Т7 Е. coli в процессе репликации (Dressier Din “Control Processes in Virus Multiplication”, ed. by D. C. Burke and W. C. Russel, Cambridge University Press, 1975).
урана невелико. При использовании обычного освещения молекулы ДНК практически нельзя увидеть. Однако они хорошо видны при использовании метода темного поля, поскольку в этом
случае фон не освещается. Электронная микрофотография молекулы ДНК, полученная методом темного поля, показана на рис, 3-18.
Следует заметить, что метод темного поля не увеличивает разрешающей способности микроскопа, а только позволяет избежать некоторых явлений при подготовке образца, которые не дают полностью проявиться разрешающей способности микроскопа. Пока еще остается непонятным, в чем заключаются относительные достоинства метода темного поля по сравнению с вариантом использования хлорида бензалкония.
Микроскоп Крева
В обычном электронном микроскопе падающий пучок электронов покрывает весь образец. Существует несколько типов взаимодействия электронов с образцом: 1) отсутствие взаимодействия (т, е. прохождение через межатомные пространства) — наиболее распространено; 2) упругое рассеяние (без потери энергии) орбитальными электронами атомов образца — также встречается достаточно часто; 3) неупругое рассеяние (с потерей энергии) ядрами атомов — встречается реже. Соотношение последних двух видов взаимодействия является характеристическим для каждого элемента, так как для каждого характерен определенный размер ядерной мишени и для более тяжелых элементов, следовательно, увеличивается доля неупругого рассеяния.
Исходя из этого был разработан новый специальный тип микроскопа. В нем пучок сжимается до очень малого (приблизительно 5 А) пятна. Это пятно быстро обегает образец, подобно тому как это делает луч на экране телевизора. При движении пучка измеряется соотношение электронов двух последних видов в каждой точке с помощью спектрометра энергии электронов. Полученное соотношение преобразуется в изображение на телевизионном экране соответствующим электронным устройством; полученная информация обрабатывается компьютером. Это новый важный шаг вперед в электронной микроскопии, дающий новый элемент анализа, поскольку здесь возможна идентификация индивидуальных атомов. В некоторых случаях предельное разрешение удается довести до 2 А. На рис. 3-19 приведены микрофотографии некоторых молекул, полученные этим методом.
Сканирующий микроскоп обратного рассеяния
