Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Сканирующий электронный микроскоп представляет собой прибор, который в течение последних нескольких лет позволил получить множество прекрасных микрофотографий клеточных поверхностей. Разрешение микроскопа ограничено 200 А, причем
РИС. 3-19.
/1 — электронная микрофотография хроматина тимуса теленка, обедненного хистоном (HI) с высоким содержанием лизина. Видно, что волокна ДНК шириной 20—30 А покрыты частицами белка со средним диаметром 135 А на расстоянии приблизительно 260 А друг от друга [Langmore L P., Wooley I Proc. Nat. Acad. Sci., 72, 2691—2695 (1975)]. Б — часть неокрашенной молекулы ДНК фага Т7, представляющая собой волокно толщиной 20—30 А. В — атомы ртути. Г — атомы урана. (Все микрофотографии получены с помощью сканирующего электронного микроскопа Крева с пропусканием и любезно предоставлены Джоном Лангмором и Альбертом Кревом.)
он работает по совершенно другому принципу по сравнению с обычным электронным микроскопом. Подобно микроскопу Крева, пучок здесь сжимается в маленькое (100 А) пятно, которое обегает поверхность образца, покрытого толстым (200 А) слоем золота или другого тяжелого металла. Когда пучок падает на металл и проходит в нем короткое расстояние, золото начинает испускать электроны вследствие вторичной эмиссии или прямо электроны пучка за счет обратного рассеяния. Поскольку угловое соотношение между числом испускаемых электронов и углом
РИС. 3-20.
Сканирующая электронная микрофотография эритроцитов крови человека (Л)? п поверхности листа герани (Б). (Любезно предоставил Томас Хайсс.)
между поверхностью и падающим пучком неожиданно очень близко, но не идентично тому, которое существует для отражения света от поверхности объекта, изображение, полученное при регистрации электронов, дает картины исследуемых поверхностей клеток. Пример сканирующей электронной микрофотографии приведен на рис. 3-20.
Список литературы
Crewe А. VA High-Resolution Scanning Electron Microscope, Sci. Amer., 224* (4), 26—35 (1971).
Davis R. W., Simon MDavidson N. GElectron Microscope Heteroduplex Methods for Mapping Base Sequence Homology in Nucleic Acid, in “Methods in Enzymology”, vol. 21, edited by L. Grossman and K- Moldave, Academic Press, 1971, pp. 413—428.
Greenstone A., The Electron Mircoscope in Biology, St. Martin’s Press, 1968. Haggis G. H., The Electron Microscope in Molecular Biology, Wiley, 1967. Hall С. E., Introduction to Electron Miroscopy, McGraw-Hill, 1966. Kleinschmidt A. /(., Monolayer Techniques in Electron Microscopy of Nucleic;
Acid Molecules, in “Methods in Enzymology”, vol. 12B, edited by L. Grossman and K- Moldave, Academic Press, 1968, pp. 361—376.
Oliver R. М., Negative Stain Electron Microscopy of Protein Macromolecu-les, in “Methods in Enzymology”, vol. 27, edited by С. H. W. Hirs and S. N. Ti-masheff, Academic Press, 1973, pp. 616—672.
Slayter E. M., Optical Methods in Biology, Wiley, 1970.
Задачи
3-1. Образец РНК-содержащих вирусов наблюдали методом негативного контрастирования. При этом обнаружено два типа частиц — равномерно светлые на темном фоне и имеющие большие темные центры. Какова структура каждой из них?
3-2. Сферический вирус был смешан со сферами из полистирола диаметром 750 А. После напыления слоя золота длина тени полистироловых сфер составила 1250 А, а вируса — 820 А. Чему равен диаметр вируса? Некоторые вирусы имеют тени в пределах от 150 до 200 А. Каковы их размеры?
3-3. ДНК № 1 имеет длину 10 мкм, № 2 — 9,5 мкм. Большая часть их молекул состоит из идентичных последовательностей оснований. Участок от 4,0 до 4,5 мкм (измерен от конца, который условились считать левым) № 1 отсутствует в № 2. Участок от 7,1 до 7,8 мкм в № 1 заменен в № 2 последовательностью, которой нет в № 1. Эти ДНК смешивали, денатурировали и ренатурировали в соответствии с гетеродуплексной методикой. Как будут проявляться гетеродуплексы?
3-4. Образец линейной двухцепочечной ДНК (все молекулы идентичны) подвергали непродолжительной обработке экзонуклеазой, атакующей только 5'-концы цепочек ДНК до тех пор, пока не расщепилось приблизительно 3% ДНК. Известно, что эти молекулы обладают концевой избыточностью, т. е. ген имеет последовательность ABCD...XYZABC, причем длина сегмента ABC составляет 1 % от общей длины ДНК. Если эти обработанные молекулы поместить в ренатурирующие условия, то получится новый тип структуры. Опишите эту структуру, указав длины различных участков в процентах от первоначальной длины.
3-5. Белок состоит из 60 сферических субъединиц, расположенных таким образом, что 6 составляют шестиугольник, а 10 шестиугольников упакованы в виде стопки один над другим. Опишите типы структур, которые будут наблюдаться: (Л) при негативном контрастировании, (?) измерении тени и (В) при использовании реплики.
3-6. Пленки-подложки обычно получают из пластика или чистого углерода. Они очень хрупки и часто ломаются. Более прочные пленки можно получить из таких металлов, как хром. Почему же не используются металлические пленки? Объясните.
