Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
нельзя увидеть при использовании любых видов микроскопии, кроме поляризационной. Примером может служить митотическое веретено (рис. 2-17) и ориентация молекул во фрагмопластах (участок границы) между растительными клетками во время деления клеток. С использованием поляризационного микроскопа и фотографирования во времени можно даже проследить развитие этих структур в живой клетке.
Пример 2-В. Идентификация спиральной структуры. Если волокна с положительным двулучепреломлением наблюдать, глядя вдоль оси волокон, они будут выглядеть черными при любом повороте. Однако, если волокно имеет спиральную структуру, оно будет выглядеть при поворачивании то темным, то светлым, причем темное изображение соответствует участкам, где плоскость спирали направлена в сторону наблюдателя. Таким образом, можно идентифицировать спиральные структуры. Например, включенные тела (упорядоченные агрегаты) вируса табачной мозаики в клетках листьев табака при поперечном разрезе оказываются спиральными.
Использование поляризационного
микроскопа для измерения дихроизма
Все обсуждаемые выше объекты являются прозрачными. Многие объекты поглощают преимущественно в определенном направлении, что называется дихроизмом (гл. 14). Дихроизм может быть внутренним или определяться формой объекта. Внутренний дихроизм обычно присущ химическим соединениям с сопряженными циклами, для которых поглощение максимально в том случае, если плоскость поляризации совпадает с плоскостью цикла.
При обнаружении дихроизма из поляризационного микроскопа удаляют анализатор и компенсатор, так как объект сам действует как анализатор. Если обладающий дихроизмом образец осветить плоскополяризованным светом с длиной волны, при которой наблюдается поглощение, и вращать его, то таким образом можно найти угол, которому соответствует наиболее темное изображение. Если известен дихроизм молекул, находящихся в известной структуре, то можно определить и ориентацию молекул в этой структуре. Эта методика не нашла широкого распространения, однако приведенные примеры показывают, что она обладает большими возможностями.
Пример 2-Г. Ориентация поглощающих групп в кристаллах. Ориентация групп гема в кристаллах гемоглобина может быть определена при наблюдении кристаллов в голубом свете. Поскольку поглощение вдоль оси b кристалла намного большее, чем в перпендикулярном направлении, плоская поверхность групп гема должна лежать вдоль оси Ь.
Пример 2-Д. Ориентация макромолекул в крупных структурах. Поглощение поляризованного ультрафиолетового (УФ) света растянутыми хромосомами указывает на общую ориентацию ДНК в хромосоме, поскольку УФ-поглощение ДНК максимально в направлении, перпендикулярном оси спирали (т. е. параллельном плоскости пар оснований).
Флуоресцентная микроскопия
Флуоресценция ¦— исключительно чувствительный метод определения минимальных количеств вещества, поскольку для любого флуоресцирующего вещества интенсивность флуоресценции пропорциональна интенсивности падающего света (гл. 15). При этом главная проблема состоит в отделении флуоресценции от падающего света. Во флуоресцентном спектрофотометре это достигается наблюдением образца под прямым углом к падающему свету. При применении флуоресцентного микроскопа задача значительно труднее и приходится использовать оптические фильтры (рис. 2-18). Фильтр, который пропускает в спектре флуоресцен-
РИС. 2-18.
Оптика флуоресцентного микроскопа.
/ - - источник света; 2 — фильтр (отделяет 3 — конденсор; 4 — объектив; 5 - фильтр
(отделяет ?„))•
цни только свет с длиной волны, соответствующей возбуждению, помещают между источником света и конденсором. Другой фильтр, пропускающий свет с длиной волны, соответствующей флуоресценции, но не возбуждающий свет, помещают между объективом и глазом наблюдателя. Таким образом, в отсутствие флуоресцентного объекта в глаз не будет попадать свет и поле будет черным. Если же объект флуоресцирует, то он будет контрастно выделяться на окружающем фоне. Для анализа слабой флуоресценции необходимо использовать покровные стекла, предметные стекла и линзы из нефлуоресцирующего стекла, поскольку любой из этих элементов может подсвечивать поле фона н достаточной степени. Напомним, что здесь нельзя применять апохроматические линзы, поскольку элементы, изготовленные из CaF2, обладают сильной флуоресценцией.
Так как лишь немногие элементы клеток обладают выраженными флуоресцентными свойствами (исключение составляют мо-.лекульг, подобные триптофану, тирозину и рибофлавину, которые
находятся во всех частях клеток), причем лишь некоторые из них можно возбудить коротковолновым видимым или ближним УФ-светом (коротковолновый УФ-свет требует специальной оптики и системы освещения), для наблюдения обычно применяют внутренний флуорофор, т. е. такой, который при добавлении связывается с определенными компонентами клетки. Чаще всего для этой цели используют акридиновый оранжевый (для нуклеиновых кислот), флуоресцеии и хинакрин.
С помощью флуоресцентной микроскопии можно увидеть компоненты, которые трудно увидеть при применении других методов, локализовать вещество путем специфического связывания и определить ориентацию с помощью поляризационной флуоресценции. Как это делается, видно из следующих примеров.
