Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
будет. Более подробную информацию можно найти в работах, приведенных в списке литературы в конце главы.) Магнитное поле генерируется обмоткой из медной проволоки. Для получения большого увеличения линзы имеют короткое фокусное расстояние, причем показано, что фокусное расстояние уменьшается с увеличением напряженности магнитного поля. Напряженность магнитного поля можно увеличить, усиливая ток в обмотке, однако это сопровождается выделением большого количества тепла. Поэтому прибегают к концентрированию поля путем помещения обмотки в кожух из мягкого железа и введения двух конических элементов из мягкого железа, которые называются полюсными
наконечниками, причем каждый из них имеет небольшой канал, через который проходит пучок. Получающееся расположение магнитных силовых линий показано на рис. 3-1, ?.
Как отмечалось ранее, приводимое короткое описание не претендует на объяснение действия электромагнитной линзы, а служит для рассмотрения ее основных частей и ознакомления с терминологией, применяемой в электронной микроскопии. Важно отметить, что расходящийся пучок электронов можно сфокусировать в определенных пределах (поскольку существует значительная сферическая аберрация) в точку на оси линзы.
Оптическая система электронного микроскопа изображена на рис. 3-1, Б. Источником излучения служит раскаленная добела вольфрамовая спираль, которая испускает электроны. Потенциал анода, к которому движутся электроны, обычно на 40—100 кВ больше потенциала спирали. Спираль и анод вместе составляют электронную пушку. Анод имеет небольшой канал, через который проходят наиболее быстрые электроны. Этот канал вместе с маленькой апертурой сжимает поток электронов, давая на выходе узкий электронный пучок. Этот пучок несколько расходится, поскольку электроны на выходе из канала отклоняются за счет положительного потенциала анода. Расходящийся пучок фокусируется на образце с помощью электромагнитной линзы — конденсора. Как правило, не следует слишком резко фокусировать пучок на образце, так как мощный поток электронов приведет к разрушению образца.
Изображение образуется за счет так называемого вычитающего действия образца. Оно заключается в рассеянии некоторых электронов атомами объекта. Распределение этой потери электронов приводит к получению изображения (таким же образом понижается поглощающим образцом интенсивность светового потока в оптическом микроскопе). Линза объектива, отрегулированная так, чтобы образец находился точно в фокусной точке, вновь фокусирует пучок с образованием изображения. Это изображение затем увеличивается в несколько стадий тремя электромагнитными линзами, которые называются дифракционная, промежуточная и проекционная. Третья, проекционная линза и дает изображение либо на флуоресцентном экране, либо на фотопластинке.
Три особенности отличают электронный микроскоп от оптического. Во-первых, электроны в воздухе не могут проходить больших расстояний, поэтому колонна микроскопа должна находиться в высоком вакууме; это означает, что объект должен быть всегда сухим, т. е. наблюдение живых объектов невозможно. Во-вторых, поскольку увеличение электромагнитной линзы пропорционально напряженности магнитного поля, которая в свою очередь пропорциональна силе тока в обмотке, увеличение можно
изменять, варьируя силу тока в катушке линзы. В оптической микроскопии это сделать невозможно по причине фиксированных размеров имеющихся линз, т. е. для достижения значительной степени увеличения необходимо иметь большой набор объективов. В-третьих, ни один из видов первичной аберрации (т. е. сферической и хроматической аберраций, гл. 2) не может быть скорректирован, так как электромагнитные линзы всегда являются собирающими. (В микроскопе Крева, который будет описан ниже, существует возможность частичной коррекции сферической аберрации.) Для уменьшения сферической аберрации, а следовательно, улучшения качества изображения, линзы должны работать при очень малых числовых апертурах. [Числовая апертура (NA) обсуждается в гл. 2.] Здесь имеет место некоторое ограничение разрешения за счет длины волны Комптона электрона, так как предел разрешения составляет 0,61 Я/NA. Для электрона длина волны Комптона K — hcjE, где Л — постоянная Планка, с — скорость света, Е — энергия электрона. Для электрона с энергией 60 кВ длина волны составляет 0,03 А. Однако в связи с тем, что числовая апертура магнитной линзы обычно составляет около 0,0005, практический предел приближается к 4 А. (Как будет показано ниже, природа объекта позволяет лишь в редких случаях достичь этого предела разрешения.) Таким образом, электронный микроскоп позволяет реально получить приблизительно в 500 раз более высокое разрешение, чем оптический микроскоп.
Методы приготовления образцов и получения контрастного изображения
Получение образцов на подложке
Поскольку все вещества обладают высокой способностью рассеивать электроны, необходимо, чтобы образец был очень тонким, иначе пучок не будет проходить через него. На практике максимально допустимая толщина составляет около 0,1 мкм (1000 А) для получения разрешения порядка 100 А и от 50 до 100 А для разрешения в 10 А. Это требование не вызывает трудностей при наблюдении вирусов, фибрилл и макромолекул, однако для большинства клеток, размеры которых составляют от 1 до 50 мкм в толщину, возникает необходимость получения тонких срезов (см. разд. «Заливка, получение срезов и окрашивание»). Это требование означает, что подложка образца (эквивалент предметного стекла в обычном микроскопе) также должна быть очень тонкой,
