Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Метод оттенения обычно менее эффективен в случае меньших макромолекул, поскольку сами тени имеют меньший размер, а влияние зернистости подложки становится значительным. Многие из этих трудностей можно обойти при использовании метода негативного контрастирования, описанного в следующем разделе.
РИС. 3-8,
Аппарат для испарения в вакууме или для нанесения пленки методом оттенения.
Вакуум под колоколом создается с помощью вакуумного и диффузионного насосов. Вольфрамовая спираль, вокруг которой обматывается проволочка из испаряемого металла, нагревает металл до кипения. В течение 10—15 с металл испаряется, образуя на образце пленку. Толщина пленки пропорциональна количеству взятого металла и обратно пропорциональна квадрату расстояния от спирали до образца. 1 — спираль; 2 — испаряющийся металл; 3— колокол; 4 — образец; 5 — платформа; 6 — основание; 7 — электроды.
РИС. 3-9.
Определение высоты объекта по длине его тени. Поскольку испарение происходит не прямо над образцом, существует участок па пленке-подложке, куда металл ие попадает.
/ — напыленный материал; 2 — сетка; 3 — образец.
РИС. 3-10.
Электронная микрофотография бактериофага Т4 Е. coli, полученная методом оттенения. Тени указаны стрелками. (Любезно предоставил Джонатан Кинг.)
Модификация метода напыления для наблюдения молекул нуклеиновых кислот, известная под названием метода Кляйн-шмидта, будет обсуждаться ниже.
Негативное контрастирование
Метод негативного контрастирования Бреннера и Хорна (часто неправильно называемый негативным окрашиванием) заключается в заливке мелких частиц или макромолекул сплошным ело-
Г
------------------------иЛ
РИС. 3-11.
Метод негативного контрастирования.
Четыре частицы залиты материалом с высокой электронной плотностью. При прохождении электронного пучка через образец ослабление пучка будет зависеть от общей толщины слоя окрашивающего вещества, поэтому через участки, содержащие частицы, будет проходить большее количество электронов, I — частицы; 2 — материал с большой электронной плотностью; 3 — отверстие сетки; 4 — пленка-подложка.
ем красителя или погружении в пленку, непрозрачную для электронов (рис. 3-11). Краситель заполняет все промежутки, но не проникает внутрь частиц. Получаемое изображение соответствует относительной плотности луча в каждой точке, которая пропорциональна толщине слоя непрозрачного материала в этой точке. Таким образом, контраст достигается благодаря тому, что частицы понижают эффективную толщину непрозрачной пленки, т. е. частицы видны в виде их очертаний. На рис. 3-12 приведена электронная микрофотография фага, полученная методом негативного контрастирования. Для этого образец либо смешивают с красителем и этой смесью опрыскивают сетку, либо сетку опрыскивают раствором образца, а затем — раствором красителя. Иногда итерпретация негативно окрашенных образцов бывает затруднена, поскольку будут наблюдаться различные картины в зависимости от толщины слоя красителя, способности его проникать в промежутки между частицами, возможной специфической адсорбции его образцом (позитивное окрашивание) и от того, где находится краситель — над частицей или под ней. Это заставляет обычно исследовать большое число частиц при различных способах приготовления образцов. Все же метод негативного контрастирования успешно используется для широкого кру-ia фагов, вирусов и белков.
Наиболее используемым красителем для негативного контрастирования является соль фосфорновольфрамовой кислоты, хотя имеются данные, что она может быть заменена иодистым кадмием. Следует иметь в виду, что разрешение в методе негативного контрастирования зависит от размера непрозрачных атомов (т. е. приблизительно в 5 А).
РИС. 3-12.
Электронная микрофотография фага Т4 Е. coli, полученная методом негативного контрастирования. Окрашивание проводили фосфорновольфрамовой кислотой. Сравните с рис. 3-10. (Любезно предоставил Джонатан Кинг.)
Позитивное контрастирование
Метод позитивного контрастирования для большинства макромолекул применяется относительно редко, поскольку обычно бывает невозможно присоединить достаточно большое число тяжелых атомов для получения хорошего контраста, хотя такая возможность имеется для очень больших молекул и структур, таких,
РИС. 3-13.
А—электронная микрофотография двух агрегатов молекул тропоколлагена, построенных по принципу сегмент — промежуток, при окрашивании фосфор-иовольфрамовой кислотой. Длина агрегата равна примерно 0,28 мкм. Зоны соответствуют частям тропоколлагена, связанным с красителем. (Любезно нрсдоставил Питер Ф. Девисон.) Б — схематическое изображение волокна коллагена. Каждая стрелка соответствует молекуле тропоколлагена; молекулы соединены бок к боку, причем перекрывание составляет одну четверть длины каждой. Эта модель явилась результатом анализа расположения зон для этой и других форм коллагена. [Hodge A. JHighberger J„ Deffner О., Schmitt F. О., Proc. Nat. Acad. Sci., 46, 197 (I960).]
как рибосомы, ДНК, РНК-полимераза и коллаген. Особенно хорошие результаты получаются в случае коллагена; полученные при этом данные заслуживают особого внимания, так как демон-стрируют большие аналитические возможности метода. При агрегации молекул тропоколлагена бок к боку с образованием коллагена полученная структура может быть окрашена фосфорноволь-фрамовой кислотой при pH 4,2 (связывание с положительно заряженными группами), в результате чего в электронный микроскоп видны группы полос (рис. 3-13). Если использовать уранил-лцетат, связывающийся с отрицательно заряженными группами, то расположение полос будет точно таким же. Поэтому агрега-
