Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
о наличии двухслойной мембраны. Процедуры заливки и получения среза сами по себе могут вносить искажения за счет смеши-
з*
РИС. 3-4.
Электронная микрофотография ультра-тонкого среза Euglena gracilis, окрашенного тстраокисью осмия (любезно предоставили Джером Шифф н Иенси О’Донохью).
1 — митохондрия; 2 — ядрышко; 3 — ядро; 4 — хлоропласт; 5 — гранула крахмала.
вания образца с органическим мономером и собственно разрезания.
При наблюдении тонкого среза получается картина, отвечающая монослою, что не всегда соответствует истинной структуре. Для получения представления об образце в целом необходимо исследовать большое число срезов. Элегантный, хотя и очень трудоемкий метод получения серийных срезов заключается в получении последовательных срезов образца с их исследованием в порядке получения.
Получение реплик
Метод, используемый для наблюдения поверхности образцов, непрозрачных для электронов или легко разрушающихся, называется получением реплик. Для этого образец покрывают тонким
покрытие платинои
платина
РИС. 3-5.
Получение углерод-платиновой реплики. В некоторых случаях пленку-подложку соединяют со слоем углерода до нанесения на поверхность воды. Для извлечения пленки затем используют чистую сетку (см. подпись к рис. 3-6).
1 — образец; 2 — держатель; 3 — пленка-подложка на сетке.
РИС. 3-6.
Реплики молекул миозина (ширина каждого снимка около 1200 А).
Раствором миозина из мышцы кролика опрыскивали поверхность свежерасщепленной слюды. После высыхания раствора сверху напыляли тонкий слой платины методом отте-нения под малым углом. На слой платины наносили слой углерода и, наконец, сверху покрывали пленкой из парлодиона. Затем слюду медленно погружали под малым углом в воду. Пленка отрывалась от слюды и плавала на поверхности. Далее пленку переносили на сетку. [Lowey S., Slayter Н. S., Weeds A. G.t Baker М., J. Mol. Biol., 42, 1 (1969) )
слоем платины, а затем для придания жесткости — поддерживающим слоем углерода, причем слои наносят напылением в вакууме или методом оттенения (shadow-casting) (см. рис. 3-8 и примечание к нему). Полученный двойной слой затем помещают на поверхность воды и переносят на сетку (рис. 3-5). Полученная реплика представляет собой оттиск поверхности объекта, т. е. ее контур совпадает с контуром объекта. Этот метод находит применение для изучения поверхностей вирусов, мембран и некоторых кристаллов белков, которые сразу же разрушаются под действием пучка электронов. Пример реплики показан на рис. 3-6.
Методы замораживания — травления (лиофилизация) и критической точки
Перед получением реплик вода должна быть удалена из образца, так как получение пленки методом огтепения необходимо проводить в вакууме. При этом возникает ряд проблем, связанных с тем, что при сушке на воздухе структуры обычно испытывают сжатие в результате эффектов поверхностного натяжения при фазовых изменениях во время испарения растворителя. Методы замораживания — травления и критической точки позволяют избежать артефактов, связанных с высушиванием. В методе замораживания — травления образец быстро замораживают, делают срез или ломают, после чего помещают в вакуум при таких давлении и температуре, когда вода возгоняется с поверхности образца (травление). Затем получают реплику этой поверх-
РИС. 3-7.
Фаг Т2 Е. coli был обработан методом замораживания — травления. Для получения реплики использовали слегка измененный метод критической точки. Хорошо видны детали поверхности хвоста фага. Сравните это изображение с изображениями, полученными другими методами (рис. 3-10 и 3-12). (Любезно предоставил Манфред Байер.)
ности путем напыления платины или углерода в вакууме. Пример реплики, полученной таким методом, приведен на рис. 3-7.
Метод критической точки основан на том, что для каждого вещества существует характеристическая «критическая температура», выше которой не может существовать жидкая фаза. Процедура заключается в следующем. Влажный образец вымачивают в этаноле, а затем этанол обменивают на жидкий СО2 под давлением при 15°С. Далее температуру образца повышают до ЗГС (критическая температура), при которой СО2 превращается в газ. При этом предполагается, что все трехмерные параметры сохраняются. После этого можно получить реплику или же образец непосредственно можно наблюдать в микроскоп, если он был предварительно окрашен. Этот метод особенно полезен, когда необходимо предохранить макромолекулярные структуры при нанесении молекул на пленку из раствора.
Метод оттенения
Электронная микроскопия изучает в основном структуры частиц, таких, как вирусы, фаги и рибосомы, и макромолекул. Данные о размерах таких объектов и некоторая информация о их структуре могут быть получены методом оттенения. Частицы (в растворе или суспензии) наносят на сетку, покрытую пленкой-подложкой методом опрыскивания. Жидкость быстро испаряется, образец помещают в вакуум, после чего напыляют тяжелый металл. Для этого требуется кипящий металл при температуре раскаленного добела вольфрама, чего можно достигнуть либо обматывая металлическую проволоку вокруг вольфрамовой спирали (рис. 3-8), либо помещая небольшие кусочки напыляемого металла в вольфрамовый контейнер. Атомы металла движутся по прямой во всех направлениях в том случае, когда вакуум достаточно высок. Если испарение проводят под острым углом (рис. 3-9), металл будет покрывать только одну сторону образца, а сетка будет покрыта полностью, за исключением участка в тени образца. Если известны вертикальное (Н) и горизонтальное (L) расстояния от источника испаряемого металла до образца, то высоту частицы над поверхностью решетки (h) можно рассчитать по длине тени, отбрасываемой образцом (d), так как h/d — HfL. Таким образом можно определить размеры частицы. На рис. 3-10 показано исследование фагов этим методом.
