Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
ш
РИС. 2-21.
Вид хромосом под флуоресцентным микроскопом.
Изображены мстафазные хромосомы периферических (циркуляция крови) лейкоцитов здорового мужчины, окрашенные хинакриновым ипритом. Заметим, что хромосомы флуоресцируют не одинаково, а выглядят как последовательность зон с различной яркостью. Хромосомы, морфологически не различимые при фазово-контрастной микроскопии или методом светлого поля с использованием стандартных методов окрашивания, легко отличаются по особенностям образования зон флуоресценции. Так, например, для 1-хромосомы характерна особенно яркая флуоресценция (указана стрелкой). Фон выглядит темным, так как флуоресцируют только хромосомы. Детально этот метод описан в работе: Casperson Т., Lomakia G.t Zech L., Hereditas, 67, 89 (1971). (Микрофотографию -любезно предоставил Эдвард Модест.)
ме того, при этом можно наблюдать хромосомные аномалии, которые нельзя увидеть другим способом; этим объясняется большая ценность метода в клинической практике. На рис. 2-21 показаны хромосомы, окрашенные хинакриновым ипритом.
Приложение
Регулировка фазово-контрастного микроскопа
Для получения фазового контраста необходимо, чтобы изображение кольца конденсора (иногда его называют фазовым кольцом) точно фокусировалось на фазовой пластинке. Этого достигают следующим путем. Конденсор и окуляр удаляют, после чего источник света устанавливают таким образом, чтобы он находился примерно по центру объектива, если смотреть вниз через тубус. Затем на столик помещают объект, окуляр вставляют на место, выбирают объектив с желаемым увеличением, ввинчивают его в тубус и фокусируют на объекте. Затем конденсор устанавливают так, чтобы изображение диафрагмы лампы было в фокусе на плоскости объекта (условия освещения Кёлера). Под окуляром помещают специальную линзу, называемую линзой Бертрана, с помощью которой можно видеть заднюю фокусную плоскость объектива, т. е. положение фазовой пластинки. Затем навинчивают требуемое кольцо конденсооа (для каждого объектива существует свое кольцо, поскольку размер кольца должен соответствовать размеру фазовой пластинки). Кольцо конденсора с помощью регулировочной ручки передвигают до тех пор, пока оно не будет концентрическим по отношению к фазовой пластинке. После этого обычно проводят окончательную фокусировку конденсора, для того чтобы изображение кольца конденсора точно совмещалось с фазовой пластинкой. Далее линзу Бертрана удаляют, после чего система готова к работе.
Список литературы
Gurr Е., The Rational Use of Dyes in Biology and General Staining Methods, Williams & Wilkins, 1965.
Martin L. C., Welford W. Т., The Light Microscope, in “Physical Techniques in Biological Research”, vol. 1A, edited by G. Oster, Academic Press, 1971, pp. 2—70.
Oster G., Birefringence and Dichroism, in “Physical Techniques in Biological Research”, vol. 1, edited by G. Oster and A. W. Pollister, Academic Press, 1955, pp. 439—459.
Osterberg H.y Phase and Interference Microscopy, in “Physical Techniques in Biological Research”, vol. 1, edited by G. Oster and A. W. Pollister, Academic Press, 1955, pp. 378—437.
Slayier Е. H.t Optical Methods in Biology, Wiley, 1970. Прекрасное исчерпывающее полное руководство.
Zernike F., Phase Contrast, a New Method for the Microscopic Observation of Transparent Objects (Parts 1 and 2), Phusica, 9, 686—693; 974—985 (1942). В этих двух статьях разработана теория фазового контраста.
Задачи
2-1. Для подсчета числа бактерий в 1 мл бактериальной культуры удобнее всего использовать фазово-контрастный микроскоп. Однако для подсчета числа вирусов этот метод непригоден из-за слишком малого размера частиц. Объясните, как для этой цели можно использовать флуоресцентную микроскопию и акридиновый оранжевый. Какое свойство вирусов следует иметь в виду, чтобы добиться оптимальных условий подсчета? Какие вирусы легче сделать видимыми, ДНК- или РНК-вирусы?
2-2. Можно ли с помощью поляризационного микроскопа заметить какое-либо различие между структурами из стопок дисков и из стопок колец?
2-3. Объясните, почему при использовании поглощающих объектов в фа-зово-контрастной микроскопии качество изображения будет плохим?
2-4. Как с помощью поляризационной микроскопии можно показать ди-хроичные свойства объекта? Одинаковое ли действие оказывает удаление поляризатора и удаление анализатора?
2-5. Определенную клеточную структуру можно окрасить в бледно-розовый цвет. Однако она будет плохо видна в обычный микроскоп со светлым полем. Какую простую модификацию микроскопа вы можете предложить, чтобы увеличить контраст между структурой и окружающей средой?
2-6. Что можно заключить относительно молекулярной структуры объекта, если при вытягивании он приобретает способность к положительному двулучепреломлению?
2-7. Во всех микроскопах обычно предусмотрена возможность изменения интенсивности освещения; для удобства наблюдения и предохранения глаза ее обычно выбирают относительно низкой. Для какого типа микроскопов желательно получить максимально возможную интенсивность освещения?
