Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Интерференционная микроскопия
Как и фазово-контрастная микроскопия, интерференционная микроскопия основана на возможности преобразования различия фаз в различия интенсивностей, однако она обладает тем преимуществом, что здесь нет ореола; кроме того, метод позволяет проводить некоторые количественные измерения. Наиболее эффективная система (система Дайсона) состоит из сложного комплекса посеребренных поверхностей и рефлекторов, который делит свет, выходящий от объекта, на части, одна из которых проходит через окружающую среду и сдвигающую фазовую пластинку. При последующей рекомбинации с остальной частью света,
которая не подверглась сдвигу по фазе, происходит интерференция. При этом сдвиги по фазе, обусловленные различиями показателей преломления и (или) толщин участков объекта, преобразуются в различия интенсивностей. При использовании белого света эти участки будут иметь различную окраску, тогда как в монохроматическом свете будет наблюдаться только различие интенсивностей.
К сожалению, прибор настолько сложен, что его устройство трудно объяснить коротко. Подробное описание устройства и работы с ним можно найти в литературе, приведенной в конце главы. Главное, что должен знать каждый студент-биолог, что имеется такой необычный микроскоп, и помнить, что он позволяет следующее:
1. Получать контрастное изображение объекта без ореола в отличие от фазово-контрастной микроскопии. Кроме того, с помощью этого микроскопа можно увидеть мелкие детали, которые недоступны для фазового метода.
2. Проводить количественные измерения, недоступные с помощью фазово-контрастного микроскопа. Можно измерить разность длин оптического пути между частицей и окружающей средой. Поскольку длина пути определяется показателем преломления и толщиной, можно измерить один из этих параметров, если другой известен. Более того, можно определить концентрацию известного вещества, если известны показатель преломления и удельный инкремент рефракции (изменение показателя преломления на единицу количества растворенного вещества). Если п.б и пр — показатели преломления белка и растворителя соответственно, то
пб — пр — ас,
где а — удельный инкремент рефракции, ас — концентрация в граммах на 100 мл. Поскольку п$ и а мало изменяются в зависимости от типа белка, пользуясь такой зависимостью, можно ориентировочно определить концентрацию белка внутри клетки.
Поляризационная микроскопия
Внимание! Преоюде чем приступить к чтению этого раздела, ознакомьтесь с разделом, посвященным плоскополяризованному свету в гл. 16,
Структуры, состоящие из вытянутых молекул, расположенных параллельно, или дисков, расположенных в виде стопки, при введении в среду с показателем преломления, отличающимся от показателя преломления частиц структуры, обнаруживают способ-
РИС. 2-14.
Структуры, дающие положительное (А) и отрицательное (?) двулучепре-ломлсние. Плоскость вектора Е проходит через каждую из них, как показано на рисунке.
ность к двулучепреломлению (рис. 2-14). Это означает, что структура будет пропускать плоскополяризоваипый свет только в том случае, когда плоскость поляризации параллельна длинным осям частиц. Это остается в силе даже тогда, когда частицы не обладают собственным двулучепреломлением, т. е. если частицы с равной вероятностью пропускают поляризованный свет, падающий под любым углом. [Двулучепреломление аналогично явлению, наблюдаемому при движении очень длинных молекул по трубке или при сдвиге градиента между коаксиальными цилиндрами (гл. 18).]
Появление двулучепреломления в клеточных препаратах легко наблюдать с помощью поляризационного микроскопа. Очень важно, что двулучепреломление можно использовать не только в аналитических целях для определения ориентации, но в ряде случаев оно является единственным свойством, делающим структуру видимой (например, когда частицы нельзя окрасить или когда их концентрация и удельный инкремент рефракции настолько малы, что не могут привести к достаточно большой разнице фаз, для того чтобы частицы можно было увидеть в фазовоконтрастный или интерференционный микроскоп).
Важнейшим компонентом поляризационного микроскопа служит поляризатор, который располагается между источником света и конденсором. Кроме того, в микроскопе имеются вращающийся столик или держатель образца, анализатор, находящийся между объективом и окуляром, который можно установить так, чтобы его ось была перпендикулярна оси поляризатора (говорят, что в этом случае поляризатор и анализатор скрещены), и ком-
РИС. 2-15.
Оптика поляризационного микроскопа.
1— источник света; 2 — линза поля; 3 — поляризатор; 4—конденсор; 5 — образец; 6 — вращающийся столик; 7— объектив; 8 — компенсатор; 9— вращающийся анализатор; 10 — окуляр.
пенсатор (рис. 2-15). Поскольку поляризованный свет легко деполяризуется под действием отражения и преломления, конденсор регулируют таким образом, чтобы объект освещался возможно более параллельным светом.
Когда поляризатор и анализатор скрещены, а объект отсутствует или является изотропным (не имеет преимущественной оси преломления поляризованного света), поле выглядит равномерно темным. Если же присутствует объект, обладающий двулучепре-ломлением, причем он расположен так, что его ось находится под углом к плоскости поляризации, отличным от 0° или от 90°, он будет разделять поляризованный свет на два компонента — параллельный и перпендикулярный относительно плоскости анализатора (рис. 2-16). Следовательно, часть света будет проходить через анализатор, в результате чего появляется яркое изображение объекта на темном фоне. При вращении объекта яркость его изображения будет изменяться, достигая максимума при угле 45° относительно поляризатора или анализатора; если же объект находится на одной линии с любым из них, то его изображение становится невидимым (для этих целей и предусмотрен вращающийся столик).
