Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
* Важно четко представлять употребляемое здесь понятие фазы. Если две синусоидальные волны движутся вдоль оси в одном направлении и имеют максимумы и минимумы в одних точках, то говорят, что они находятся в фазе. Если максимум одной волны совпадает с минимумом другой, они находятся друг от друга на расстоянии в половину длины волны, или 180°, при этом волны находятся в противофазе и при наложении взаимно уничтожаются.
3
РИС. 2-12.
Оптика фазово-контрастного микроскопа.
/ — отклоненный свет; 2 — пеотклоненный свет; 3 — плоскость изображения (освещена неотклоненным светом, сдвинутым по фазе); 4— кольцевая апертура (фазовое кольцо); 5 — плоскость объекта; 6 — объектив; 7 — фазовая пластинка; 8 — интерференция.
в результате чего объект освещается полым конусом света. Если объект отсутствует, полый конус света проходит через плоскость объекта и попадает в объектив с образованием маленького светового кольца. На задней фокусной плоскости объектива (со стороны окуляра) конденсор образует кольцевое изображение. В этой точке устанавливают фазовую пластинку, состоящую из диска с кольцевой канавкой глубиной в одну четверть длины волны или с дополнительным слоем, толщиной также в одну четверть длины волны. Обычно для создания дополнительного слоя применяют прозрачную пленку, прикрепляемую прямо на поверхность одной из линз объектива. Размер фазовой пластинки точно совпадает с размером изображения кольца конденсора. Таким образом, весь свет, проходящий через кольцо конденсора, будет отставать или опережать на одну четверть длины волны в зави-симрсти от того, снабжена фазовая пластинка канавкой или дополнительным слоем. Если теперь взять объект, на котором происходит дифракция падающего света, то становится ясным, что свет нулевого порядка (неотклоненный) будет проходить через фазовую пластинку, тогда как свет, подвергшийся дифракции (выходящий под углом или отклоненный), будет проходить через остальную апертуру объектива. Кроме того, чтобы сделать близкими интенсивности отклоненного и неотклоненного света (свет нулевого порядка всегда более интенсивен, чем свет высших порядков), на фазовую пластинку можно поместить тонкую пленку из алюминия или серебра (не изменяющую фазу, но только задерживающую свет).
При рекомбинации отклоненного и неотклоненного света в объективе они различаются по фазе на половину длины волны —¦
условие, при котором происходит гасящая интерференция. Таким образом, фон выглядит темным, а действительная интенсивность зависит от относительной интенсивности отклоненного и неоткло-ненного света (это определяется толщиной пленки алюминия на фазовой пластинке). При наличии объекта свет состоит из двух компонентов — проходящего через объект и проходящего через среду, причем свет, отклоняемый объектом, будет интерферировать с гашением только с нсотклоненным светом в одном и том же положении плоскости изображения. Вспомним, что объект сам по себе вызывает различие в фазах, поскольку его показатель преломления отличается от показателя преломления среды. Это различие фаз при наложении различия, вызываемого фазо-вой пластинкой, приводит к исчезновению гасящей интерференции. Следовательно, объект будет выглядеть более ярким, чем фон. (Если иеотклоненный свет опережает отклоненный на одну четверть длины волны, то объект будет выглядеть темным на светлом фоне.) Ясно, что степень потемнения каждого объекта зависит от его показателя преломления и толщины.
Этот простой способ позволяет сделать видимыми «невидимые» объекты. Единственным недостатком фазово-контрастной микроскопии по сравнению с интерференционной (см. следующий раздел) является неизбежный ореол, которым окружен объект. Это обусловлено дифракцией на фазовой пластинке. На рис. 2-13 (см. также рис. 2-11) наглядно видна разница в микрофотогра-
РИС. 2-13.
Микрофотографии фибробласта мыши, полученные методом светлого поля (Л) и фазово-контрастным методом (Б). Обратите внимание на существенно лучший контраст на снимке Б.
фиях одной и той же клетки, полученных методом светлого поля и фазово-контрастным методом.
Регулировка фазово-контрастного микроскопа очень сложна, поскольку при этом должны удовлетворяться не только все требования обычной микроскопии, но, кроме того, кольцо конденсора должно находиться точно по центру и фокусироваться на фазовой пластинке. Метод регулировки описан в приложении к этой главе.
Применение фазово-контрастной микроскопии
К образцам в фазово-контрастной микроскопии предъявляется лишь одно требование — должно отсутствовать поглощение, поскольку метод основан только на различиях фаз. Для поглощающих объектов (например, окрашенных клеток) различие в интенсивностях будет складываться с фазовыми эффектами и часто приводит к понижению контраста и плохому качеству изображения.
Фазово-контрастная микроскопия имеет большое значение для наблюдения органелл живых клеток (рис. 2-13). Ядра сильно контрастируют с цитоплазмой, и компоненты цитоплазмы, такие, как митохондрии, вакуоли и капельки жира, хорошо видны. Также видны ядрышки и хромосомы. Мембраны можно определить как темные линии с ярким ореолом с обеих сторон, в результате чего одинарную мембрану трудно отличить от двойной. Детали маленьких объектов различить трудно; для бактерий, например, увидеть детали мешает ореол клеточной стенки. Однако если бактерию поместить в среду, показатель преломления которой такой же, как и клеточной стенки или цитоплазмы (например, концентрированные растворы альбумина бычьей сыворотки), то относительно легко увидеть такие внутренние детали, как ядерные тельца.
