Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
клеток. Известны сотни таких веществ, многие из которых преимущественно (хотя абсолютная специфичность встречается редко) реагируют с белками, липидами или нуклеиновыми кислотами. Существуют ли красители, обладающие реальной специфичностью к определенным химическим группам, — это вопрос дискуссионный. Техника окрашивания образцов описана во многих руководствах по микроскопии и гистохимии (см. список литературы в конце главы). Для достижения достаточного контраста и получения количественной информации из данных микроскопии разработано пять специальных методов: метод темного поля, фазово-контрастная, интерференционная, поляризационная и флуоресцентная микроскопия. Ниже мы рассмотрим каждый из этих методов отдельно, а также примеры их использования.
Метод темного поля
Рассмотрим критическое освещение объекта, помня при этом, что свет на выходе из конденсора образует сплошной конус (рис. 2-8, Б). Если в плоскости объекта объект отсутствует, то
плоскость плоскость
ойгекта изображения
РИС. 2-10.
Оптика в методе темного поля.
1 — источник света; 2 — свет, подвергшийся дифракции; 3 — объектив; 4 — кольцевая апертура (вид снизу).
поле будет равномерно освещенным (светлое поле). Если в конденсор или ниже его ввести непрозрачный диск с прозрачным кольцом (рис. 2-10), то плоскость объекта будет освещена полым конусом света, который, пройдя через плоскость объекта, выходит в виде второго полого конуса. Если размер кольца достаточно велик, полый конус будет окружать объектив и при этом свет не будет попадать в объектив; в таком случае поле станет темным. Однако, если объект находится в плоскости объекта, свет на нем будет подвергаться дифракции и некоторые полосы дифракции будут появляться под таким углом, что они попадут в объектив. Хотя интенсивность этого света мала, на темном фоне будет получаться более светлое изображение. Такое изображение содержит малое число деталей (информация теряется за счет отбрасывания света нулевого порядка), однако достигается хороший контраст, причем его можно регулировать изменением интенсивности источника света и степени, в которой удаляются внутренние отражения в системе. Следовательно, метод темного поля полезен при подсвете небольших частиц, которые трудно >видеть на светлом поле. В настоящее время этот метод используется редко вследствие его низкого разрешения. Если данный микроскоп не снабжен приспособлением для проведения наблюдений методом темного поля, то темного поля можно добиться разрегулировкой источника света и конденсатора таким образом, чтобы в объектив свет либо вообще не попадал, либо попадал в малой степени. На рис. 2-11 приведены изображения неокрашенной бактерии, полученные с помощью обычной и фазово-контрастной микроскопии и метода темного поля.
РИС. 2-11.
Микрофотографии бактерий (Е. coli) при наблюдении их методами светлого (Л) и темного (Б) поля, а также в фазово-контрастный микроскоп (В). Обратите внимание, что на снимке Л бактерии почти не видны.
Фазово-контрастная микроскопия
Рассмотрим прозрачный диск в прозрачной среде, освещаемый параллельным светом, который падает перпендикулярно плоскости диска. Диск при этом практически невидим, поскольку интенсивность света, проходящего через диск и окружающую его среду, одинакова. Однако свет, проходящий через диск, будет отличаться по фазе от света, проходящего через среду, в том случае, когда показатели преломления диска и среды не совпадают, поскольку световые волны задерживаются при прохождении через прозрачное вещество (гл. 16) *. Однако ни глаз человека, ни фотопленка не могут различить свет, отличающийся по фазе; следовательно, диск остается невидимым.
Если объекты очень малы, то образование изображения не может быть точно описано с позиций геометрической оптики; на самом деле оно является результатом двух дифракционных процессов. Падающий свет сначала испытывает дифракцию на объекте, а затем — на апертуре объектива. Это означает, что каждая точка объекта и каждая точка объектива вносят свой вклад в образование каждой точки изображения путем интерференции всех дифракционных волн.
Рассмотрим теперь свет, попадающий в объектив после того, как он прошел через точку в прозрачном диске. Этот свет главным образом состоит из света, подвергшегося дифракции нулевого порядка, т. е. это прямой луч, который можно назвать неот-клоненным светом. Свет, подвергшийся дифракции, образует максимумы под различными углами к волнам нулевого порядка, поэтому его можно назвать отклоненным светом. Он отличается по фазе от неотклоненного на одну четверть длины волны. Свет, проходящий через среду, также разделяется на отклоненный и неотклоненный. Однако все эти волны рекомбинируют в объективе и проецируются на плоскость изображения, давая изображение за счет взаимодействия волн, находящихся в различных фазах.
В фазово-контрастной микроскопии различие фаз можно преобразовать в различие интенсивностей с помощью простого приема (рис. 2-12). В фокусной плоскости под конденсором помещается кольцевая апертура (такая же, как в методе темного поля),
