Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
того, что все лучи, выходящие из одной точки, не проходят через одну и ту же точку на изображении. Наиболее типична сферическая аберрация (рис. 2-3, ?), состоящая в том, что лучи, выходящие из одной точки на оптической оси линзы, преломляются в различных частях линзы и поэтому фокусируются в различных точках оптической оси. Вторым важным видом аберрации изображения точки является так называемая кома, при которой изображение точки имеет форму кометы, что вызывает постоянное нарушение симметрии изображения объекта. Эти виды аберрации легко корректируются с помощью соответствующих конструкций линз. Такие линзы называются апланатическими. Еще одним видом аберрации является астигматизм. Если не требуется самого высокого разрешения (как в электронной микроскопии, где это имеет исключительную важность), этот вид аберрации часто не корректируют. В случае необходимости для коррекции применяют линзы, называемые анастигматами. Все продающиеся микроскопы подвергаются коррекции на аберрацию перед их установкой.
Теория физической оптики объясняет получение изображения и пределы разрешения; важность последнего будет обсуждаться в разделе, посвященном фазово-контрастной микроскопии. В основе физической оптики лежит представление о свете не как о лучах, движущихся по прямой линии, а как об электромагнитных волнах, которые подвергаются дифракции на отверстии и на кромке и могут интерферировать с усилением или гашением. Так как линза в принципе является отверстием, свет, проходящий через нее, будет подвергаться дифракции. Это приводит к тому, что освещенная точка на объекте будет появляться в плоскости изображения в виде кружка, который к тому же окружен серией широких концентрических колец, являющихся результатом усиливающей интерференции. В микроскопии эти кольца носят название дисков Айри (рис. 2-4, Л). Установлено, что радиус первого темного кольца вокруг центрального диска равен 0,61 %/п sin U, где X— длина волны света, п — показатель преломления линзы на стороне, обращенной к объекту, a U — угол между осью линзы и линией, проведенной из точки пересечения плоскости объекта с осью линзы до кромки отверстия (рис. 2-4, Б). Это приводит к тому, что две точки на объекте, расположенные близко друг от друга, будут выглядеть на изображении как два тонких диска, поэтому разрешение этих точек (т. е. способность однозначно определить, что это действительно две точки) зависит не только от разделения этих точек на изображении в соответствии с принципами геометрической оптики, но и от размеров получающихся тонких дисков. Положение, при котором разрешение пропадает, точно определить невозможно (рис. 2-4, В). В связи с этим с давних пор было принято, что предел разрешения равен
0,61 Х/п sin U. С уменьшением длины волны разрешение повыша-
плоскость
обзекта
В
наложение
неполное
разрешение
полное
разрешение
РИС. 2-4.
Л — зависимость интенсивности света, испускаемого источником света диа-мет ром d, от расстояния. Изображение представляет собой яркое центральное пятно, окруженное светлыми кольцами (диск Айри). Чем меньше становится d, тем больше значение х. Величина центрального участка в основном определяет разрешение близко расположенных точек. При уменьшении d значение х также уменьшается, что приводит к улучшению разрешения с уменьшением длины волны. Б — изображение угла U. В — разрешение двух точечных объектов.
ется; к этому же приводит увеличение и л, и С/, причем для увеличения U нужно либо уменьшить расстояние от объекта до линзы, либо увеличить диаметр линзы. (К этому мы вернемся ниже.) Величина п sin U называется числовой апертурой. Эта величина всегда обозначается на объективах микроскопов буквами NA (от английского numerical aperture). Увеличение разрешения при увеличении угла U можно объяснить следующим образом. Когда свет попадает на объект, он подвергается дифракции самим объектом. Дифракционные полосы различных порядков будут выходить из точки объекта под различными углами, которые увеличиваются с увеличением порядка дифракции. Если каждую полосу дифракции рассматривать как носитель части информации для получения изображения объекта, то максимум информации может быть получен в том случае, когда будет собран весь свет, подвергшийся дифракции. Отсюда ясно, что желательно иметь максимальный угол сбора между объектом и отверстием линзы, т. е. большое значение угла U.
Устройство микроскопа
Микроскоп состоит из трех основных частей: источника света с постоянной яркостью, предметного столика и увеличивающих линз с коррекцией различных видов аберрации. Однако для получения очень большого увеличения фокусное расстояние должно быть небольшим и глаз должен находиться практически на противоположной стороне линзы. Чтобы избежать трудностей, связанных с изгогозлением линз с очень коротким фокусным расстоянием с введением коррекции, позволяющей глазу находиться па доступном расстоянии от линзы, вводят дополнительную систему линз, называющуюся окуляром. Основная система линз (линзы объектива) вместе с окуляром составляет основу микроскопа (рис. 2-5). Объект помещают чуть дальше фокусной плоскости объектива. При этом увеличенное (10—100X) и перевернутое изображение образуется за точкой фокуса со стороны получения изображения. Окуляр несколько увеличивает это изображение (2—20Х) и фокусирует его на сетчатке глаза, которая находится на удобном для работы расстоянии.
