Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Конденсорные линзы
А. Критическое освещение
Б. Освещение Кёлера
РИС. 2-8.
Типы освещения, используемые в микроскопии.
/ — источник света; 2 —матовое стекло; 3 — конденсор; 4 — плоскость объекта микроскопа; 5 — объектив; 6 — лампа накаливания; 7 — полевая линза; 8 — полевая диафрагма; 9 — промежуточная диафрагма; 10 — задняя фокусная плоскость конденсора; 11 — плоскость объекта.
ских целей) и ахроматический (улучшает цветовую коррекцию).
Вероятно, наибольшее число недоразумений при работе с микроскопом вызывает регулировка конденсора. Конденсор используют для получения либо критического освещения, либо освещения Кёлера (рис. 2-8, А). В критическом освещении свет источника фокусируется конденсором так, чтобы объект освещался конусом света. На практике это означает, что положение конденсора относительно объекта регулируется таким образом, что пятно освещающего света должно быть по возможности наименьшим, если смотреть невооруженным глазом, и возможно более ярким, если смотреть через окуляр и объектив, сфокусированный на объекте. Критическое освещение используют очень широко; оно требует наличия перед источником рассеивающего экрана, чтобы избежать получения на объекте изображения нити накаливания источника света. Этот метод иногда приводит к излишним затратам света, однако он очень прост. Линзы конденсора выбираются таким образом, чтобы их значение NA было не меньше, чем у объектива, для того, чтобы заполнить апертуру объектива.
Освещение Кёлера более интенсивно и допускает более точный контроль. Между конденсором и источником света помеща-
ется дополнительная линза, называемая полевой линзой (рис. 2-8, ?), которая дает изображение в том случае, когда источник находится в фокусной плоскости конденсора, в действительности в фокусной точке. Все лучи света после конденсора являются параллельным пучком. Они проходят через объект под различными углами, которые возрастают с увеличением расстояния точек источника от оптической оси. Таким образом, объект освещается набором пучков, составляющих световой конус *. Конденсор можно отрегулировать таким образом, что изображение полевой линзы будет находиться в плоскости объекта, а изображение лампы — на задней фокусной плоскости объектива. Этого достигают уменьшением полевой диафрагмы (рис. 2-8, Б) и фокусированием ее на объекте с помощью конденсора. При этом по-
РИС. 2-9.
Устройство микроскопа. Тубус и конденсор могут независимо двигаться вдоль оптической оси для фокусировки.
1 — глаз; 2— окуляр; 3 — тубус; 4 — объектив; 5 — образец; 6 — покровное стекло; 7 — стеклянная пластинка; 8 — столик; 9 — конденсор; 10 — апертура; // — зеркало; 12 — лампа.
* В действительности это не конус, так как нить накаливания лампы не круглая. Однако размер и положение полевой диафрагмы позволяют использовать в качестве источника только малую часть нити лампы.
лучается освещение такое же, как и полевой линзы. Конденсор или промежуточную диафрагму обычно добавляют для контроля NA освещающего светового пучка.
Полная схема типичного микроскопа показана на рис. 2-9.
Регулировка микроскопа
Для подготовки микроскопа к работе необходимо провести следующую регулировку: 1) источник света и все его компоненты должны быть отцентрированы по оптической оси прибора; 2) объектив необходимо сфокусировать и 3) требуется отрегулировать освещение. В большинстве обычных (стандартных) микроскопов конденсор, объектив и окуляр коаксиальны, поэтому центрировать требуется только источник света. Это достигается путем фокусировки на микроскопном стекле, удаления окуляра и перемещения источника свега с помощью регулировочного винта до тех пор, пока свет (при наблюдении в тубус) не будет находиться в центре объектива. Если регулируется и установка по центру конденсора, то конденсор вначале вынимают, источник света центрируют, как описано выше, затем конденсор ставят на место и с помощью регулировочного винта центрируют по источнику света. Затем конденсор фокусируют на объекте для критического освещения или, как обсуждалось выше, для освещения Кёлера. Промежуточная диафрагма (рис. 2-8, Б) должна быть постоянно отрегулирована таким образом, чтобы NA линзы была заполнена; это можно установить, если из тубуса вынуть окуляр и посмотреть, полностью ли освещен объектив. Для того чтобы избежать влияния рассеянного и отраженного света, полевую диафрагму следует уменьшить так, чтобы освещен был только объект. Если интенсивность освещения мешает удобному наблюдению, то ее можно уменьшить. Для уменьшения интенсивности ни в коем случае нельзя изменять апертуры, для этого либо вводят перед источником света нейтральные плотные фильтры, либо уменьшают напряжение, подаваемое на источник.
Контраст
Чтобы объект был видимым, его изображение должно отличаться по интенсивности от окружающего фона. Различие в интенсивностях объекта и фона называется контрастом. К сожалению, большинство биологических образцов (клетки и их компоненты) прозрачны, т. е. их контраст близок к нулю. В прошлом для решения этой проблемы образцы окрашивали, прибавляя окрашенные вещества, которые реагировали с определенными компонентами
