Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Поляризация флуоресценции
Интенсивность поляризованного света, прошедшего через поляризатор, зависит от ориентации поляризатора — пропускание максимально, когда плоскость поляризации света параллельна оси поляризатора, и равно 0, когда перпендикулярна (см. рис,
16-1, Б). Поляризация Р луча света, который только частично поляризован, может быть определена как
(7)
где /ц и /х — наблюдаемые интенсивности параллельной и перпендикулярной относительно произвольной оси составляющих излучения. Поляризация может меняться от —1 до +1. Она равна нулю, когда свет не поляризован; в остальных случаях ее •можно называть частичной поляризацией. Поляризацию флуоресценции можно изучать, используя стандартную экспериментальную схему для измерения флуоресценции (рис. 15-3) с несложной модификацией (рис. 15-13): на пути возбуждающего
света помещается поляризатор, чтобы возбуждать флуоресценцию образца поляризованным светом, а второй поляризатор помещается между образцом и детектором, причем его ось либо параллельна, либо перпендикулярна оси первого поляризатора.
СП
7
РИС. 15-13.
¦Схема экспериментальной установки для измерения поляризации флуоресценции.
А — источник света; 2 — монохроматор возбуждения; 3 — поляризатор; 4 — держатель ^кюветы с образцом; 5—испускаемый свет; 6—монохроматор испускания; 7 —детектор.
Если возбуждающий свет поляризован, то обычно наблюдается, что флуоресценция либо только частично поляризована, либо полностью не поляризована. Причина потери поляризации объясняется дальше; будет показано, что величина изменения поляризации дает информацию о физическом состоянии излучающей группы.
Прежде всего, необходимо напомнить, что поглощение поляризованного света хромофором максимально, когда плоскость поляризации света параллельна особой оси хромофора, называемой электрическим дипольным моментом (см. гл. 16). Обычно хромофоры беспорядочно ориентированы (это, несомненно, справедливо для растворов); следовательно, вероятность поглощения возбуждающего поляризованного света пропорциональна cos20r где 0 — угол между плоскостью поляризации и электрическим дипольным моментом. Кроме того, плоскость поляризации испускаемого света определяется не дипольным моментом поглощения, а собственным дипольным моментом перехода (который обычно не параллелен дипольному моменту поглощения), и вероятность испускания флуоресценции с плоскостью поляризации под углом ф к дипольному моменту перехода пропорциональна sin20. Учитывая эти вероятности, получим, что, если поглощающие группы расположены беспорядочно {но стационарно) и два диполя не параллельны, поляризация Р флуоресценции <7г. (Фактически, даже если поглощающие группы совершенно выравнены по отношению к плоскости поляризации возбуждающего света, величина Р< 1 благодаря sin20.) Тот факт, что Р всегда <1, называется деполяризацией флуоресценции.
Многие другие факторы могут увеличивать степень деполяризации; наиболее важными с точки зрения биохимии являются два из них: 1) движение поглощающей группы и 2) перенос энергии между одинаковыми хромофорами. Если излучающая группа вращается очень быстро (т. е. если имеет место броуновское движение), так, что происходит значительное изменение ориентаций за время жизни возбужденного состояния, поляризация будет понижаться дополнительно. Это важное явление, потому что на степень деполяризации такого типа влияют температура, вязкость растворителя, а также размер и форма молекулы, содержащей излучающую группу. Второй фактор — перенос энергии между идентичными хромофорами — обусловлен тем, что, хотя резонансный перенос энергии с наибольшей вероятностью происходит между молекулами, имеющими параллельные диполи, он происходит и в том случае, когда они не параллельны, приводя к деполяризации. Так как эффективность переноса энергии уменьшается с шестой степенью расстояния между донором и акцептором, этот тип деполяризации очень зависит от концентрации.
Собственная (предельная) поляризация Р0 —это поляризация,
которая наблюдалась бы, если бы поглощающая молекула была лишена подвижности и располагалась далеко от всех других молекул (т. е., если бы не было ни эффекта молекулярного движения, ни переноса энергии). На практике это поляризация, наблюдаемая при очень низких концентрациях флуоресцирующего хромофора и в растворителе очень высокой вязкости. Отметим, что под низкой концентрацией может подразумеваться либо низкая концентрация комплекса макромолекула — флуоресцирующий хромофор, либо большое расстояние между хромофорами, связанными с одной макромолекулой. При очень высокой вязкости и высокой концентрации обнаруживается главным образом эффект переноса энергии, а при низкой вязкости и низкой концентрации — эффект молекулярного движения. Эти эффекты могут быть использованы для получения такой информации о макромолекулах, которую нелегко получить другими методами.
