Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Первый метод измерения 8' состоит в определении тушения флуоресценции донора, т. е. тушения флуоресценции при Яг, если донор возбужден к\. Пусть 2— интенсивность флуоресценции при ?.2, возбужденной Яь a fD и fD>A соответственно представляют флуоресценцию для случаев, когда присутствует только донор или и донор, и акцептор. Доля молекул донора, которая остается возбужденной, составляет 1—¦$', или
Во втором методе измеряется интенсивность испускания при Яз. В этом случае соответствующее уравнение имеет вид
где eiA и e\D — молярные коэффициенты погашения акцептора и донора соответственно при Яь СА и CD — концентрации акцептора и донора соответственно и /ьзл и fuzDfA—интенсивности флуоресценции при Яз, возбужденной Яь если присутствует соответственно либо акцептор, либо пара донор — акцептор.
После того как измерили 8', если известно Rq, можно оценить R (R0 обычно рассчитывают из различных спектральных параметров, но иногда определяют, измеряя Sf в системе, для которой известно R).
Чтобы использовать измерения переноса энергии для определения расстояния, желательно, чтобы удовлетворялись следую-
(4)
(5)
(6)
РИС. 15-11.
Формула фрагмента поли-ь-пролина, содержащего на концах дансильнук> (акцептор) и (ьнафтильную (донор) группу (п меняется от 1 до 12).
Расстояние, А
РИС. 15-12.
Эффективность переноса энергии как функция расстояния между хромофорами в дансил-(Ь-пролил) »-а-нафтиле, где п меняется от 1 до 12. Расстояния (в А) для каждого значения п были определены с помощью независимых измерений. Сплошная линия соответствует зависимости 1/R6. [Из Stryer L., Haug-land R. P., Proc. Nat. Acad. ScL, 58r 719—726 (1957).]
щие условия: 1) система состояла из одного донора и одного акцептора; 2) для данной пары донор — акцептор была бы известна величина RQf и она должна быть близка к величине измеряемого расстояния; 3) известна взаимная ориентация донора и акцептора, с тем чтобы стало ясно, является ли низкая эффективность переноса энергии результатом большого расстояния или неблагоприятной ориентации (см. гл. 14, в которой обсуждаются эффекты ориентации и поглощение); 4) добавление флуоресцирующих хромофоров не приводило бы к изменению структуры изучаемой макромолекулы.
Пригодность данного метода для определения расстояния была продемонстрирована при изучении линейного-полимера, в котором дансильная и а-нафтильная группы разделены фрагментами поли-1*-пролина известной длины (рис. 15-11). Эти молекулы были возбуждены при длине волны, лежащей в области поглощения а-нафтильной группы, и была измерена флуоресценция дансильной группы как функция числа пролиновых остатков. Эффективность переноса была рассчитана так, как описано ранее. Когда отложили 8' как функцию длины полипролиновой цепи, было найдено, что она изменяется как 1/R6 (рис. 15-12).
Несколько примеров показывают, какого типа информацию получают путем измерений переноса энергии.
Пример 15-К. Близость триптофана к активному центру кар-боангидразы. Фермент карбоангидраза содержит в активном центре атом цинка. Если с атомом цинка связан донор — л«-ацетил-бензолсульфаниламид, возбуждение этого хромофора вызывает флуоресценцию триптофана. Следовательно, остаток триптофана должен находиться недалеко от активного центра.
Пример 15-JI. Расстояние между гидрофобными группами в сывороточном альбумине быка (САБ). По мере того как возрастают количества АНС, добавленного к САБ, индуцированная флуоресценция АНС вначале возрастает, а затем уменьшается. Причиной уменьшения является перенос энергии между соседними молекулами АНС. Величина эффекта дает приблизительное представление о расстоянии между неполярными участками.
Эксимеры
Изредка возбужденная молекула может образовать комплекс с идентичной невозбужденной молекулой, который будет существовать до тех пор, пока возбужденная молекула излучает. Это описывается следующей схемой, где А — поглощающая молекула, Л* — возбужденная поглощающая молекула и D — димер:
A -j- фотон А* (возбуждение)
А* -[- А D* (образование возбужденного
димера)
D* -> А + А + фотон (флуоресценция димера)
Комплекс D* называется эксимером; его узнают по появлению новой полосы флуоресценции при длинах волн больших, чем таковые обычного спектра испускания. Его спектр возбуждения идентичен со спектром возбуждения мономера в отличие от спектра возбуждения, наблюдаемого при резонансном переносе энергии и состоящего из спектров поглощения донора и акцептора (рис. 15-10).
Образование эксимера — явление, зависящее от концентрации, и его можно использовать, чтобы показать наличие высоких локальных концентраций флуоресцирующего хромофора. До сегодняшнего дня оно очень мало использовалось в биохимии, но, несомненно, найдет применение в будущем. Например, путем исследования эксимеров флуоресцирующих хромофоров можно получить информацию о наличии везикулы или какой-то субчастицы, способной концентрировать некоторые вещества.
