Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Температура, °С
субстрат, Q не меняется, что свидетельствует либо об отсутствии триптофана в месте связывания, либо, если триптофан находится в месте связывания, о том, что его окружение имеет полярный характер. Когда с ферментом связан субстрат, иодид тушит только 15% флуоресценции; отсюда 0,15/0,30=72 триптофановых остатков на поверхности недоступна растворителю, когда связан субстрат. Следовательно, V2'2 = 1 триптофан находится в активном центре.
В процессе титрования фермента 18% флуоресценции тушится, а величина рК, связанная с этим тушением, представляет собой р/С гистидина. Следовательно, поблизости от одного из триптофановых остатков должен быть гистидин (правило 7). Если фермент титровать после связывания субстрата, Q не меняется, т. е. в присутствии субстрата гистидин не может быть оттитрован. Отсюда в месте связывания содержатся как гистидин, так и триптофан, и субстрат может связываться непосредственно с гистидином.
В примере 15-Г было сделано допущение, что Q всех триптофановых остатков одинаков. На деле это, конечно, не так (например, один или несколько из них могут быть недалеко от карбоксильных групп). Если это допущение неверно, расчет числа триптофановых остатков будет недействительным. Однако ценность этого простого анализа состоит в том, что он предоставляет рабочую гипотезу о структуре белка; эта гипотеза должна затем проверяться другими методами.
Пример 15-Д. Изучение зависимости конформации белка от концентрации NaCl с помощью тушения иодид-ионом. На конформацию многих белков в растворе влияет содержание в растворителе NaCl. Это можно изучать, анализируя величину тушения, вызванного иодид-ионом. Рассмотрим, например, белок, для которого по мере уменьшения концентрации NaCl до нуля понижается концентрация иодида, необходимая для того, чтобы вызвать данную степень тушения (рис. 15-6). Следовательно» при низкой концентрации соли структура белка становится более открытой,
И , необходимая йля тушения на 30%
РИС. 15-6.
Зависимость концентрации иодид-иона, необходимой для уменьшения на 30% трипто-фановой флуоресценции белка, от концентрации NaCl.
так, что большее число триптофановых остатков становится доступным иодиду и может взаимодействовать с ним. К тому же, если в отсутствие NaCI максимальное тушение составляет только 50% от тушения иодидом свободного триптофана, то тогда можно заключить, что в этих условиях структура не может представлять собой беспорядочный клубок, так как 50% триптофановых остатков еще недоступны растворителю. Отметим, что тушение иодидом является общим методом изучения перехода спираль — клубок, индуцированного любым агентом, который не влияет на способность иодида тушить флуоресценцию.
„Внесенная" флуоресценция (метод флуоресцентных меток и зондов)
Природа не всегда снабжает макромолекулу флуоресцирующим хромофором в удобном для экспериментатора участке молекулы. Однако во многих случаях флуоресцирующий хромофор может быть введен в изучаемую молекулу либо путем образования химической связи, либо путем простого связывания * (как при использовании «репортерных» групп в абсорбционной спектроскопии). Использование во флуоресцентном анализе таких дополнительных групп называется методом «внесенной» флуоресценции**. Применимость этого метода ограничена несколькими требованиями к флуоресцирующему хромофору: 1) он должен прочно связываться со строго определенным участком макромолекулы; 2) его флуоресценция должна быть чувствительна к условиям окружения; 3) он сам не должен оказывать влияния на свойства исследуемой макромолекулы. Эти три критерия необходимо всегда проверять. Для белков наиболее распространенными флуоресцирующими метками и зондами являются: 1-анилин-8-нафта-линсульфонат-аиион (АНС); 1-диметиламинонафталин-5-сульфо-нат-анион (ДНС) и его хлорангидрид, дансилхлорид; 2-п-толун-дилнафталин-6-сульфонат-аниои (ТИС); родамин; флуоресиеин, а также изотиоцианаты родамина и флуоресцеина. В случае нуклеиновых кислот используются различные акридины (акридиновый оранжевый, профлавин, акрифлавин) и этидийбромид (рис. 15-7). Ценное качество АНС, ДНС и ТИС заключается в том, что в водных растворах они флуоресцируют очень слабо. Од-
* Для таких хромофоров используются соответственно термины: «флуоресцентная метка» и «зонд».— Прим. перев.
** Русский эквивалент — «метод флуоресцентных меток и зондов^.— Прим, перев.
АН*
¦С,н,
РИС. 15-7.
Структура общеупотребимых флуоресцентных меток и зондов.
1 — профлавин; 2 — акридиновый оранжевый; 3 — флуоресцеин; 4—родамин В; 5 — Ьанилин-в-нафталинсульфонат-анион (АНС); 6 —* дансилхлорид; 7 — этидийбромид; ? —
хинакринхлорид.
нако в неполярном окружении Q заметно увеличивается и спектр сдвигается в область более коротких длин волн, причем оба эффекта возрастают по мере уменьшения полярности окружения (рис. 15-8). Исследование модельных соединений дало возможность установить приблизительное соотношение между Q и степенью «неполярности». Дансилхлорид и изотиоцианаты имеют денное свойство — они реагируют с определенными аминокислот-
