Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Пример 15-0. Изучение перехода спираль — клубок в белках. Для некоторых белков отсутствует простой оптический метод наблюдения перехода спираль — клубок. Если к белку можно присоединить флуоресцирующий хромофор (например, АНС) без изменения конформации, появляется возможность, измеряя поляризацию флуоресценции, наблюдать переход спираль — клубок, потому что, когда белок разворачивается, поляризация
уменьшается вследствие возрастания гибкости молекулы белка (следствие 4 в табл. 15-2).
Метод поляризации флуоресценции может быть также использован для обнаружения S—S-связей в денатурированном белке. Принцип состоит в том, что предельное состояние бесструктурного неупорядоченного клубка должно характеризоваться максимальной гибкостью и, следовательно, минимальной поляризацией. Отсюда полностью денатурированная молекула, содержащая S—S-связи, не будет иметь минимальную поляризацию, пока не разорвутся S—S-связи. Это означает, что если добавление агента, разрушающего S—S-связи (например, мер-каптоэтанола), приводит к понижению поляризации, то S—S-связи должны были присутствовать вначале. Метод поляризации флуоресценции, вероятно, является наиболее чувствительным методом для обнаружения таких тонких изменений.
Пример 15-П. Структура комплекса ДНК— флуоресцирующий хромофор: пример определения ориентации красителя по поляризации флуоресценции. Флуоресцирующий хромофор акридиновый оранжевый прочно связывается с ДНК. Так как он является эффективным мутагеном, структура такого комплекса представляет некоторый интерес. Будучи связанным с ДНК, акридиновый оранжевый не подвергается некоторым свойственным ему химическим реакциям (например, реакции диазотирования), на основании чего можно предположить, что он каким-то образом располагается внутри двойной спирали ДНК. Будучи связанным с ДНК, акридиновый оранжевый флуоресцирует не только при возбуждении в области своей собственной полосы поглощения, но также при возбуждении светом, поглощаемым только основаниями ДНК, что указывает на перенос энергии от оснований. Квантовый выход при этом переносе энергии очень велик, так что акридиновый оранжевый (имеющий плоскую структуру) должен находиться очень близко от оснований. Известно направление плоскости поляризации флуоресценции акридинового оранжевого относительно плоскости его колец и длинной оси, так что, если бы систему лишить подвижности, можно было бы, измеряя плоскость поляризации флуоресценции по отношению к молекулам ДНК (используя свет, поглощенный акридиновым оранжевым, а не основаниями), определить ориентацию молекул акридинового оранжевого относительно ДНК. Флуоресценция акридинового оранжевого сильно поляризована, что указывает на значительное уменьшение подвижности. Если бы он в результате связывания не имел возможности перемещаться относительно спирали ДНК, следовало бы ожидать такую низкую подвижность, поскольку ДНК настолько сильно вытянута, что имеет очень низкий коэффициент диффузии. Недоступность диазотиро-
ванию, близость к основаниям и очевидная жесткость связывания свидетельствуют о том, что слабое связывание с внешними группами, такими, как фосфаты полинуклеотидной цепи, маловероятно. Путем ориентации комплекса акридинового оранжевого и ДНК в потоке через капиллярную трубку (см. гл. 13) была определена плоскость поляризации флуоресценции акридинового оранжевого; оказалось, что плоскость связанного кольца акридинового оранжевого перпендикулярна оси спирали. Так как основания также перпендикулярны оси спирали, а наблюдаемая ранее резонансная миграция энергии указывает на близость друг к другу молекул акридинового оранжевого и основа-ний, разумно интерпретировать полученные данные следующим образом: акридиновый оранжевый интеркалирует между парами оснований. Это согласуется со слабым связыванием акридинового оранжевого с одноцепочечной ДНК и с многочисленными данными других физических измерений.
Другие применения поляризации флуоресценции
Поляризация флуоресценции может быть использована для определения ориентации молекул в жестких системах и гидродинамических свойств некоторых растворов. Далее следует несколько примеров такого рода.
Пример 15-Р. Определение ориентации молекул хлорофилла в хлоропластах с помощью поляризации собственной флуоресценции. Поляризацию красной флуоресценции хлорофилла в отдельном хлоропласте можно измерить с помощью флуоресцентного поляризационного микроскопа (см. гл. 2). Путем измерений, выполненных с искусственно иммобилизованным хлорофиллом, были определены углы между плоскостью поляризации флуоресценции и осями хлорофилла. Следовательно, зная из эксперимента плоскость поляризации флуоресценции хлоропла-стов, можно определить ориентацию молекул хлорофилла в хлоропластах.
Пример 15-С. Определение ориентации ДНК в хромосомах с помощью поляризации «внесенной» флуоресценции. В примере 15-П было показано, что флуоресцирующий хромофор акридиновый оранжевый интеркалирует между парами оснований ДНК и что его плоскость перпендикулярна оси спирали. Этот краситель также связывается внутри клеток с хромосомами эукариотов. С помощью флуоресцентного поляризационного микроскопа была измерена поляризация флуоресценции акридинового оранжевого относительно оси вытянутых хромосом, и эти данные были
