Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
В разделах, посвященных переносу энергии и поляризации, будут даны другие примеры использования метода флуоресцентных меток и зондов.
Метод флуоресцентных меток и перенос энергии
Рассмотрим систему, содержащую два флуоресцирующих хромофора (/ и 2), спектры поглощения и испускания которых показаны на рис. 15-10. Чтобы измерить спектр возбуждения (или действия) флуоресценции, выбирается длина волны (например, Я3), лежащая в спектре испускания (например, в максимуме)
Ai A, А,
РИС. 15-10.
Спектры двух флуоресцирующих хромофоров (сплошные кривые представляют спектры поглощения или возбуждения, а штриховые линии — спектры испускания).
А и Б — спектры поглощения и испускания хромофоров / и 2 соответственно; В — спектр возбуждения (регистрация при Х3, соответствующей максимуму в спектре испускания хромофора 2), когда нет переноса энергии между хромофорами / и 2; Г — то же, что и в части В, но с переносом энергии; Д — спектр испускания, возбуждение при когда происходит перенос энергии между хромофорами 1 к 2.
хромофора 2. Под спектром возбуждения имеется в виду зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны возбуждающего света. Спектр возбуждения будет одинаковым со спектром поглощения (рис. 15-10, В) в том случае, если спектр поглощения обусловлен одним электронным переходом. Это не всегда так, но это допущение приемлемо для нашей цели. Однако иногда спектр возбуждения хромофора 2 (рис. 15-10, Г) будет очень отличаться от его спектра поглощения, представленного одной полосой тем, что флуоресценция возбуждается при поглощении в области более коротких длин волн по сравнению со спектром поглощения. Это почти всегда происходит из-за того, что в некоторых случаях энергия, поглощенная одним хромофором (донором), может быть безызлучательно передана другому хромофору (акцептору), находящемуся на некотором расстоянии. Это называется резонансным переносом энергии, необходимым, но не достаточным условием которого является перекрывание спектра
испускания донора со спектром поглощения акцептора (рис.
15-10) *.
Отметим, что при наличии переноса энергии происходит уменьшение интенсивности флуоресценции хромофора 1 (возбуждение проводят при длине волны, лежащей в спектре поглощения хромофора 1). Ясно, что это своего рода тушение, особенно в том случае, если молекула акцептора не является флуоресцирующим хромофором. Однако перенос энергии легко обнаружить, снимая полный спектр флуоресценции, потому что будет видно (рис. 15-10, Д), что спектр флуоресценции, возбуждаемый при содержит новую, более длинноволновую полосу. Другими словами, нужно проверять, имеет ли место безызлучательный перенос энергии всякий раз, когда наблюдаемый спектр испускания нельзя отнести за счет возбуждения при длине волны, которую используют для возбуждения данного хромофора.
До сих пор рассматривался перенос энергии между различными флуоресцирующими хромофорами, но перенос энергии может также иметь место между идентичными флуоресцирующими хромофорами, поскольку спектры поглощения и испускания хромофора часто перекрываются. Признаком такого переноса служит следующее наблюдение: когда в образец вводятся возрастающие количества флуоресцирующего хромофора, интенсивность флуоресценции понижается без понижения поглощения при длине волны возбуждения, т. е. Q уменьшается. (Чтобы это происходило, должны выполняться не только обычные условия, необходимые для переноса энергии, но, кроме того, Q должен быть меньше, чем 1.) Очевидно, что этот вид переноса энергии является своего рода тушением.
Важность явления переноса энергии для биохимических исследований состоит в том, что эффективность переноса зависит от расстояния и взаимного расположения флуоресцирующих хромофоров и поэтому может использоваться для измерения расстояний между молекулами. Эффективность переноса энергии V описывается следующим уравнением:
8' = -----5---, (3)
К + *6)
где R— расстояние между донором и акцептором, R0— константа для каждой пары донор — акцептор, которая может быть рас-
* Упрощенным было бы то объяснение, что донор излучает фотон, который затем поглощается акцептором, и вероятность переноса энергии есть просто произведение вероятностей испускания и поглощения. Однако, хотя испускание и повторное поглощение, конечно, возможны, это не то, что происходит при резонансном переносе энергии, и вероятность переноса описывается выражением, называемым интегралом перекрывания. [Это различие описано детально в статье Forster T.f Disc. Faraday Soc., 27, 7—17 (1959).]
считана но некоторым параметрам спектров поглощения и испускания акцептора и донора. Важность исследования переноса энергии становится очевидной, если уравнение (3) переписать в виде
(См. гл. 17, в которой обсуждается введение спиновых меток для измерения расстояний между молекулами с помощью ядерного магнитного резонанса.)
Чтобы понять, как измеряется , обратимся к рис. 15-10, на котором показаны спектры поглощения и испускания донора и акцептора. Рассмотрим два метода, в которых используются три длины волны, %2 и Яз, выбранные следующим образом: при поглощает донор и не поглощает акцептор; Яг — длина волны, которая имеется в спектре испускания донора и отсутствует в спектре испускания акцептора, и Яз — длина волны, лежащая только в спектре испускания акцептора.
