Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 15-8.
Эффект добавления сывороточного альбумина быка (САБ) к АНС: 0 означает отсутствие САБ; /, 2 и 3 указывают на возрастающие количества САБ.
600
Длина волны, нм
ными остатками в белках. Эти вещества широко используются для обнаружения неполярных участков в белках, потому что при связывании с такими участками их флуоресценция возрастает.
В следующих примерах показано, как могут быть использованы флуоресцентные метки и зонды.
Пример 15-Е. Определение свойств участка связывания гема в гемоглобине. Гемоглобин представляет собой комплекс белка, апогемоглобина, с небольшой простетической группой. Хромофор АНС флуоресцирует при добавлении к растворам апогемоглоби-на и не флуоресцирует в случае гемоглобина. Прибавление гема к комплексу апогемоглобин — АНС приводит к исчезновению флуоресценции за счет вытеснения АНС, так что АНС и гем должны присоединяться к одному и тому же неполярному участку. Зная точную величину Q для окружения различной полярности и величину спектрального сдвига, можно оценить степень «непо-лярности».
Исследования такого рода могут дать полезные сведения для интерпретации рентгенограмм. Например, таким образом можно узнать, что некоторые сочетания аминокислот (например, сильнополярные кластеры) не могут быть местом взаимодействия с простетической группой.
Пример 15-Ж. Обнаружение конформационного перехода в ферменте при связывании субстрата. При добавлении к а-химо-трипсину ТНС флуоресцирует и, следовательно, должен с ним связываться. ТНС не является конкурентным ингибитором ферментативного гидролиза различных субстратов, так что он не может присоединяться к участку связывания субстрата. Однако добавление субстрата вызывает уменьшение флуоресценции. Это уменьшение могло быть результатом уменьшения связывания (ТНС флуоресцирует только в том случае, если он связан) или умень-
шения полярности участка связывания ТНС Используя флуоресценцию для исследования связывания, получили зависимость флуоресценции от концентрации ТНС в присутствии и в отсутствие субстрата; в обоих случаях константы связывания одинаковы. Следовательно, количество связанного ТНС не уменьшается, а понижение флуоресценции указывает на уменьшение полярности места связывания. Изменение полярности могло происходить в результате перемещения полярной группы около места связывания или в результате «раскрытия» полярной группы — в любом случае конформационный переход вызван связыванием субстрата. Отметим также, что с помощью такого флуоресцентного анализа можно определить параметры связывания субстрата и изучить влияние различных агентов на связывание и на конформационный переход в белке.
Пример 15-3. Присутствие в сывороточном альбумине быка (САБ) связанных жирных кислот. Если приготовить различные образцы САБ и добавить АНС, наблюдается флуоресценция АНС, но величины Q и А,Макс меняются от образца к образцу. Изменение Q ввиду его значительной величины не может быть обусловлено изменением полярности места связывания, и, следовательно, оно происходит благодаря варьированию числа мест связывания, т. е. меньшее количество АНС связано в тех образцах, которые имеют слабую флуоресценцию. Если образцы САБ обработать липофильным растворителем, квантовые выходы и спектральные сдвиги становятся одинаковыми для всех образцов. Очевидно, в результате экстракции липофильным растворителем некоторые неполярные участки становятся недоступными АНС. Однако при анализе содержимого растворителя было показано, что из образцов с сильной флуоресценцией экстрагируются жирные кислоты. Следовательно, так называемые чистые образцы кристаллического САБ могут содержать связанные жирные кислоты. Ясно, что по флуоресценции АНС можно оценивать чистоту образцов САБ и изучать связывание жирных кислот с САБ — например, определять константы связывания.
Пример 15-И. Определение числа цепей полинуклеотидов. При связывании с полинуклеотидами наблюдается увеличение квантового выхода Q и сдвиг Ямакс флуоресцирующего хромофора акридинового оранжевого (рис. 15-9). Когда добавлены насыщающие количества акридинового оранжевого, значения Хмакс значительно отличаются для двухцепочечных (зеленая флуоресценция) и одноцепочечных (красная флуоресценция) полинуклеотидов. Следовательно, таким простым путем можно различить двух-и одноцепочечные структуры. Если в образце содержатся и одно-, и двухцепочечные полинуклеотиды, в спектре флуоресценции будет два пика, соответствующие двум значениям Хм*ко
Длина волны, нм
РИС. 15-9.
Влияние двухцепочечиых (верхние штриховые линии) полинуклеотидов (например, ДНК) и одноцепочечных (нижние штриховые линии) полинуклеотидов (например, денатурированная ДНК или РНК) на флуоресценцию акридинового оранжевого.
Сплошной липисн изображен спектр свобоДЕтго акридинового оранжевого. Отношение числа молекул красителя к числу нуклеотидных остатков может быть низким (а) и высоким (б). Отметим, что ДНК вызывает увеличение флуоресценции, не оказывая влияния на ?.макс, и что это увеличение снижается но мере добавления большого количества красителя. Одноцепочечиые полинуклеотиды тушат флуоресценцию и сдвигают спектр в красную область. Это объясняет тот факт, что при добавлении к клетке акридинового оранжевого в высокой концентрации ядерный материал дает зеленую флуоресценцию, в то время как цитоплазма, содержащая РНК, — оранжевую.
