Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Stryer L., Fluorescence Spectroscopy of Proteins, Science, 162, 526—540 (1968). Хороший обзор по переносу энергии.
Timasheff S. N.t Some Physical Probes of Enzyme Structure in Solution, in “The Enzymes", vol. 2, ed. by P. D. Boyer, Academic Press, 1970, pp. 371—443.
Udenfriend S., Fluorescence Assay in Biology and Medicine, vols. 1 and 2, Academic Press, 1962, 1969.
Weber GPolarisation of the Fluorescence of Macromolecules: 1. Theory and Experimental Methods; 2. Fluorescent Conjugates of Ovalbumin and Bovine Serum Albumin, Biochem. J. 51, 145—155; 15o—167 (1952). Классические статьи по деполяризации флуоресценции.
Weber G., Teale F. W. J., The Interaction of Proteins with Radiation, in “The Proteins”, vol. 3, edited by Neurath H., Academic Press, 1966, pp. 445—452.
Задачи
15-1. Белок вызывает флуоресценцию АНС. Если концентрацию белка увеличить до прибавления АНС, флуоресценция понижается. Дать два возможных объяснения понижению флуоресценции.
15-2. Для определения доступности триптофановых остатков растворителю можно использовать тушение триптофановой флуоресценции иодид-ионами.
Известно, что белок содержит только один триптофаи, флуоресценция которого не тушится иодид-ионами. Каковы возможные объяснения отсутствия тушения?
Известно, что белок содержит восемь триптофановых остатков и иодид-ионы тушат 25% флуоресценции. Напрашивается предположение, что два триптофановых остатка доступны растворителю. Укажите несколько фактов, которые могли бы сделать это заключение необоснованным.
15-3. Когда образуются эксимеры, их спектр возбуждения совпадает со спектром мономера, потому что мономер возбуждается до димеризации. Если присутствует много димеров и димер возбуждается, можно ли ожидать, что спектр возбуждения будет соответствовать спектру поглощения мономера? Поясните.
15-4. Интенсивность флуоресценции понижается вследствие тушения иодид-ионом. Можно ли ожидать также изменения формы спектров возбуждения и испускания?
15-5. Дайте описание нескольких возможных механизмов возрастания квантового выхода флуоресцирующего хромофора при связывании с ним другой молекулы. Почему иногда могут быть сдвиги спектров возбуждения (или испускания) или обоих вместе? Происходит ли сдвиг в сторону длинных или коротких длин волн?
15-6. Всегда ли спектр возбуждения флуоресцирующего хромофора такой же, как спектр поглощения? Поясните.
15-7. Белок, содержащий десять триптофановых остатков, имеет сильную триптофановую флуоресценцию. Маленькая молекула, способная прочно связываться с белком, фактически не изменяет его флуоресценции, хотя известно, что в участке связывания имеется два триптофановых остатка. Дайте несколько возможных объяснений этому.
15-8. Когда флуоресцирующий хромофор акридиновый оранжевый связывается с ДНК и смесь облучается светом, который поглощается акридиновым оранжевым, в ДНК происходят необратимые химические изменения (например, разрушаются пуриновые кольца, рвутся одноцепочечные спиральные структуры). Чтобы происходили эти изменения, необходимо присутствие молекулярного Ог; поэтому этот процесс называется фотосенсибилизирован-ным окислением или фотоокислением. Такие реакции происходят со многими акридиновыми производными; эффективность реакции приблизительно пропорциональна квантовому выходу флуоресценции. Предложите механизм фотоокисления.
15-9. Флуоресцирующий хромофор ковалентно присоединен к белку. Измерена поляризация флуоресценции в зависимости от ионной силы буфера, в котором суспендирован белок; найдено, что она заметно уменьшается по мере возрастания ионной силы. Как влияет на белок возрастание ионной силы?
15-10. В белке имеется флуоресцирующий хромофор Ft ковалентно связанный в одном определенном месте. Когда возбуждают триптофан, трипто-фановая флуоресценция очень слаба, но флуоресцирующий хромофор сильно испускает. Поясните каждое из следующих возможных наблюдений. (Отметим, что это альтернативные и взаимоисключающие наблюдения.')
Иодид-ион тушит флуоресценцию F, а не триптофана.
Иодид-ион тушит флуоресценцию F и триптофана.
Доведение pH до 9 приводит к исчезновению флуоресценции F и увеличению флуоресценции триптофана (допустим, что отсутствует влияние pH на свободный триптофан или несвязанный F).
Доведение pH до 9 приводит к исчезновению флуоресценции триптофана и заметному увеличению флуоресценции F.
Дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм
В этой главе представлена другая группа методов, позволяющих исследовать как конформацию макромолекулы или комплекса с участием макромолекулы в растворе, так и взаимодействия макромолекул. Хотя значительную информацию такого рода дает абсорбционная спектроскопия, изучая взаимодействие с веществом поляризованного света, т. е. используя методы дисперсии оптического вращения (ДОВ) и кругового дихроизма (КД) (быстрые и применимые к растворам), можно получить еще более ценную информацию (несмотря на то, что теория метода и применяемые приборы более сложны по сравнению с абсорбционной спектроскопией). С помощью этих методов измеряют в зависимости от длины волны способность оптически активного хромофора вращать плоскополяризованный свет (ДОВ) и по-разному поглощать поляризованный по кругу вправо и влево свет (КД). В основе ДОВ и КД лежат одни и те же физические законы, и фактически оба эти метода представляют собой просто два разных способа изучения одного и того же явления: взаимодействия поляризованного света с оптически активными молекулами. Так как оптически активные центры содержатся в большинстве биологических молекул, для изучения последних могут с успехом применяться методы ДОВ и КД.
