Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Пример 15-Ф. Флуоресцентная микроскопия. Многие флуоресцирующие хромофоры локализованы внутри клеток и могут быть обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии. Образец освещается светом с длиной волны возбуждения, и далее ведется наблюдение через фильтр, который задерживает возбуждающий свет и пропускает флуоресценцию. Акридиновый оранжевый связывается с нуклеиновыми кислотами и флуоресцирует в зеленой или оранжевой области в зависимости от того, связан он с ДНК или РНК соответственно. Это было использовано в случае эукариотов для обнаружения нуклеиновых кислот и хромосом и для обнаружения РНК в ядре; в случае прокариотов — для локализации ДНК. (см. гл. 2 и рис. 2-19 и 2-21.)
Пример 15-Х. Метод флуоресцирующих антител. Антитело к определенному веществу (например, вирусному антигену или компоненту клеточной стенки) связывается с флуоресцирующим красителем. Если антитело инкубировать с клетками, содержащими антиген, и затем отмыть, то при исследовании клеток с помощью флуоресцентной микроскопии флуоресценция будет наблюдаться только там, где присутствует антиген. Этот метод широко используется для обнаружения антигенов опухолей и для идентификации внутриклеточных вирусов. Более полное описание метода дано в гл. 2, а на рис. 2-20 приведен пример его использования.
Пример 15-Ц. Определение S—S-связей и SH-групп. В 1 н. NaOH флуоресценция меркурацетата флуоресцеина потушена
э/ толь mnw Число S-5-связей на молекулу,
Белок определенное методом
титрования МАФ химическим
Сывороточный альбумин
человека 18 17
Лизоцим 3.9 А
Трипсин 5.9 6
Инсулин 3.0 3
Химотрипсиноген 5,3 5
В
РИС. 15-15.
Л — измерение числа S—S-связей по тушению флуоресценции меркурацетата флуоресцеина (МАФ); Б — структура флуоресцирующего хромофора; В — сравнение результатов с данными, полученными другими методами. [Из Ка-rush F., Klinman N. RMarks RAnalyt. Biochem., 9, 100—114 (1964).]
дисульфидными связями белка. Этот факт лежит в основе довольно точного способа определения указанных связей. Для калибровки (рис. 15-15) необходимо использовать белок с известным числом S—S-связей и SH-rpynn (например, рибонуклеазу). При нейтральных значениях pH флуоресценция тушится, наоборот, SH-группами, а не S—S-связями.
Пример 15-4. Исследование ферментов. Для многочисленных гидролаз (например, холинэстеразы, липазы, гиалуронидазы п р-галактозидазы), оксидоредуктаз (например, арилгидроксилаз, пероксидаз и оксидаз), трансамииаз, дегидрогеназ, изомераз, киназ и декарбоксилаз применяется флуоресцентный анализ, в котором нефлуоресцирующие вещества превращаются во флуоресцирующие и наоборот. Примером необычной чувствительности такого анализа могут служить данные, полученные Б. Рот-маном [Proc. Nall. Acad. Sci, 47, 1981—1991 (1961)], который измерил активность одной молекулы р-галактозидазы. Очищенная р-галактозидаза была разбавлена и диспергирована на капельки объемом приблизительно 10-9 мл, каждая из которых содержала нефлуоресцирующее вещество флуоресцеинди- (Р-е>-галактопиранозид) в известной концентрации. При гидролизе это-
го вещества получается флуоресцеин. С помощью микроскопа, снабженного фотоумножителем и имеющего апертуру, позволяющую наблюдать одну каплю, была измерена флуоресценция каждой капли. В этих каплях можно было обнаружить флуоресцеин в концентрации 2-10—6 М или 1,7* 106 молекул на каплю. Так как одна молекула фермента гидролизует приблизительно 2-105 молекул субстрата в час, флуоресцеин можно было обнаружить спустя приблизительно 10 ч. Метод использовали для определения числа молекул фермента в одной бактерии Е, coli.
Пример 15-Ш. Количественное определение ДНК. Флуоресцирующий хромофор этидийбромид прочно связывается с ДНК; при этом значительно возрастает его квантовый выход. Это увеличение линейно в широких пределах, и данные по интенсивности флуоресценции раствора, содержащего малые количества ДНК и этидийбромид используют для определения конц. ДНК.
Увеличение Q также использовалось для обнаружения ДНК, которая подвергалась электрофорезу в полиакриламидном и агарозном гелях (см. рис. 9-11). Если гель, содержащий ДНК, погрузить в раствор этидийбромида, он впитает флуоресцирующий хромофор. Если затем гель подвергнуть действию возбуждающего света, станут видны полосы ДНК в виде зон с интенсивной флуоресценцией.
Список литературы
Chen R. F., Edelhoch Н., Steiner R. F., Fluorescence of Proteins, in “Physical Principles and Techniques of Protein Chemistry”, part A., edited by S. J. Leach, Academic Press, 1973, pp. 171—244.
Kronman M. J., Robbins F. M., Buried and Exposed Groups in Proteins, in "Fine Structure of Proteins and Nucleic Acids”, vol. 4, edited by G. D. Fasman and S. Timasheff, Dekker, 1970, pp. 271—416.
Pesce A. JRosen C. G., Fluorescence Spectroscopy, Dekker, 1971.
