Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
а Согласно стандартной терминологии, смещение \1акС в макромолекуле измеряется относительно *магС свободной аминокислоты в воде.
Информация о конформации и участках связывания в белках, полученная путем изучения собственной флуоресценции белков
В следующих примерах показано, как, проводя простые измерения флуоресценции, можно делать довольно серьезные заключения о структурных особенностях белков. Необходимо отметить, что во многих случаях можно ограничиться измерением относительной флуоресценции. (Выражение «свободная аминокислота» всегда означает, что аминокислота растворена в воде.)
Пример 15-А. Конформационная перестройка в гипотетическом ферменте, индуцируемая связыванием кофактора. Интенсивность флуоресценции остатков триптофана в гипотетическом ферменте намного больше, чем интенсивность флуоресценции свободного триптофана, и характерная для них Лмакс флуорес-
РИС. 15-4.
Спектр флуоресценции гипотетического белка в растворе.
А — без кофактора; Б — с добавленным кофактором; В — спектр свободного триптофана в воде.
ценции расположена в области более коротких длин волн (рис. 15-4). Значит, они должны находиться в неполярном окружении (правило 2 в табл. 15-1). При добавлении кофактора интенсивность флуоресценции понижается и Ямакс сдвигается в область более длинных длин волн. Следовательно, конформация фермента должна измениться (правило 4) так, что либо триптофан становится доступным полярному растворителю — воде, либо он теперь располагается по соседству с заряженными группами. Добавление иодид-ионов или ионов цезия не оказывает влияния на спектр флуоресценции фермента ни до, ни после связывания кофактора. Следовательно, триптофан не попал на поверхность, а, возможно, переместился в более полярную внутреннюю область белка.
Отметим, что ввиду этих изменений флуоресценции величина одного из параметров (например, интенсивность при определенной длине волны, величина Ямакс или Q) могла быть использована для изучения связывания. Значит, зависимость параметров флуоресценции от концентрации кофактора можно применить для определения стехиометрии связывания и констант диссоциации, используя стандартные методы химии ферментов.
Пример 15-Б. Свойства активного центра фермента. Известно, что в гипотетическом ферменте имеется единственный остаток триптофана и что его флуоресценция характеризуется почти такой же Ямакс, как свободного триптофана; на основании этого можно предположить, что остаток триптофана находится в полярном окружении (правило 2). Можно предположить, что поблизости располагается тушитель, так как величина Q низкая. Титрование фермента при кислых значениях pH приводит к понижению Q, и рК этого перехода такой, как для карбоксила. Следовательно, величина Q обусловлена близостью карбоксила (правило 7). Добавление субстрата вызывает смещение Ямакс в область более коротких длин волн и увеличение Q. Смещение Ямакс указывает на то, что триптофан попадает в менее полярное окружение (правила 2 и 4). Это может означать, что либо произошел конформационный переход, в результате которого триптофан пе-
РИС. 15-5.
Изучение перехода спираль—клубок в белке по изменению флуоресценции. Отметим, что в 0,15 М NaCl белок более устойчив, поскольку для осуществления перехода требуется более высокая температура.
реместился в менее полярную область, либо триптофан находится в активном центре или вблизи от него и что связывание субстрата исключает присутствие воды. На основании увеличения Q можно предположить, что теперь тушащий эффект карбоксила не имеет места. Вероятное, но не единственное объяснение состоит в том, что триптофан располагается в активном центре и что субстрат связывается или с триптофаном, или с карбоксилом.
Пример 15-В. Изучение денатурации белка. При повышении температуры от 20 до 63°С Q триптофана гипотетического белка медленно и постепенно падает. Следовательно, остатки триптофана находятся в полярном окружении (правило 5). Между 63 и 65°С квантовый выход заметно возрастает (рис. 15-5), так что в интервале от 63 до 65°С должен быть конформационный переход, в результате которого меняется доступность остатков триптофана растворителю (правило 5). Это изменение Q может быть использовано для изучения перехода спираль — клубок с тем, чтобы можно было исследовать влияние на процесс различных параметров (например, концентрации соли, pH и т. д.).
Пример 15-Г. Локализация остатков триптофана в гипотетическом ферменте. Известно, что в ферменте имеется пять триптофа-новых остатков, Q которых выше, чем свободного триптофана. Это свидетельствует о расположении некоторых из них в неполярных участках (правило 2). Если белок нагреть от 20 до 55°С, понижение Q будет составлять только 35% от величины, найденной для свободного триптофана, что дает возможность предположить, что 0,35- 5, или ~2, триптофановых остатка располагаются на поверхности (правило 5). Если добавить иодид-ион в высокой концентрации, 30% флуоресценции тушится, что также согласуется с наличием двух триптофановых остатков на поверхности (правило 3). Ни в том, ни в другом случае тушение не равняется 40%, потому что три внутренних триптофановых остатка находятся в относительно неполярном окружении и, следовательно, их вклад составляет более трех пятых величины Q. Если добавить
