Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Применение инфракрасной спектроскопии
Приведем краткое описание относительно распространенных об-ластей применения ИК-спектроскопии.
Определение относительного содержания а-спирали, 0-структуры и беспорядочного клубка в белках по интенсивностям различных амидных полос, например полосы амид /. Возможность ЭТОГО обусловлена тем, ЧТО 1 Амане полосы амид I отличаются для а-спирали, p-сгруктуры и беспорядочного клубка. Они составляют 1650 и 1658 см"1 для а-спирали и беспорядочного клубка, соответственно и 1632 и 1685 см-1 для p-структуры. Наибольшую чувствительность имеет ИК-спектр по отношению к р-форме.
Идентификация обменивающегося атома водорода. Частоты многих полос изменяются при замещении дейтерия на водород. Обычно известно, какой функциональной группе (карбонильной, окси-, аминогруппе) соответствует данная полоса; наблюдая за тем, какие полосы изменили свое местоположение в спектре, можно идентифицировать группы, в которых возможен обмен. Так как обычно атомы водорода некоторых функциональных групп (например, оксигруппы) обмениваются быстро, то замедленное изменение vMaKc в этих группах указывает на замедление обмена; это, как правило, означает, что группа труднодоступна.
Идентификация числа водородных связей и функциональных групп, участвующих в образовании водородных связей, и изучение разрыва водородных связей при денатурации. Это может быть сделано, например, путем растворения макромолекулы в D20, денатурации образца и наблюдения за тем, какие полосы, соответствующие дейтерированным группам, появляются в процессе денатурации.
Идентификация таутомерных форм по появлению новых полос. Предположим, что некоторая молекула содержит окси-группу, но ее ИК-спектр указывает на присутствие карбонильной группы. Это является серьезным доказательством наличия таутомерии. Если эта молекула входит в состав макромолекулы, относительные интенсивности полос, соответствующих окси- и карбонильной группам, могут изменяться по сравнению со свободной молекулой — одна из полос может даже исчезнуть. Такого рода данные обычно указывают на химическую структуру мономерного звена в полимере. Это было особенно важно для понимания структуры нуклеотидов и влияния различных нуклеотидов на частоту мутаций.
Изучение взаимодействия между небольшими молекулами, -такими, как рибофлавин и аденин, и связывание белка с лигандом. Эти процессы приводят, как и в случае абсорбционной спектроскопии в ультрафиолетовом свете, к характерным изменениям v и интенсивности полос.
Определение отношения числа А-U-к числу G*C-nap в тРНК. Для двух типов пар оснований наблюдаются полосы при различных значениях v. Это было использовано для того, чтобы сделать выбор между структурами, показанными на рис. 14-21.
Титрование карбоксильных групп белка. Некоторые «спрятанные» карбоксильные группы титруются при значениях pH, которые сильно отличаются от обычных значений для этих групп и лежат в области, где титруются другие группы, способные к ионизации (см. пример 14-Д, в котором описан аналогичный эксперимент, проведенный в УФ-свете). Наблюдать за ионизацией карбоксильных групп можно по спектральным изменениям в D2O.
Использование поляризованного ИК-света для определения ориентации водородных связей в вытянутых пленках белков и полипептидов путем установления ориентации С = 0- и NH-групп. Возможность таких измерений обусловлена тем, что эти группы поглощают сильнее всего тогда, когда они параллельны вектору Е. Это можно использовать для обнаружения а-спирали, учитывая, что теоретическое отношение величины поглощения для случаев, когда вектор Е параллелен и перпендикулярен оси белка («дихроичное отношение»), составляет 44 при 3300 см~: (валентное колебание NH—). Если измеряемое отношение близко к этой величине, велика вероятность а-спиральной структуры. Само теоретическое значение достигается редко, так как ориентация полипептидных цепей в пленке не может быть совершенной. Из измеряемых дихроичных отношений при 3300 и 1660 см-1 (валентное колебание С = 0) можно, кроме того, рассчитать величину максимального угла, который эти группы образуют с осью молекулы. Информация такого типа представляет собой большую ценность при интерпретации рентгенограмм.
Спектроскопия комбинационного рассеяния
Как правило, при рассеянии света его частота не меняется (так называемое упругое рассеяние); однако небольшая часть излучения, обычно в инфракрасной области, рассеивается неупруго с изменением частоты. Это называется рассеянием Рамана. Изменение частоты в процессе рассеяния отличается от изменения
РИС. 14-23. КР-спектр диоксана.
1800 1400 1000 600 200
Волновое число, см-1
частоты, с которым мы встречаемся при флуоресценции (гл. 15), тем, что не происходит перехода на более высокий электронный уровень. Причиной изменения частоты является либо возбуждение на более высокий колебательный уровень, либо добавление к электромагнитной энергии световой волны колебательной энергии молекулы.
Если в процессе рассеяния свет возбуждает рассеивающий центр на более высоком колебательном уровне, энергия теряется и частота уменьшается. С другой стороны, если рассеивающий центр находится на более высоком колебательном уровне (например, за счет предварительных столкновений с молекулами растворителя), он может передавать свою колебательную энергию падающему свету и таким путем увеличивать его частоту. При обычно используемых температурах число молекул, обладающих запасом колебательной энергии, меньше, чем число молекул, не обладающих таковым, поэтому чаще частота уменьшается. Таким образом, спектроскопия комбинационного рассеяния, как и ИК-спектроскопия, изучает колебательные переходы. Ранее, ввиду отсутствия источников света высокой интенсивности и очень низкой интенсивности рассеянного света, метод КР-спектроскопии применялся относительно редко. К тому же изменения частот так малы, что требуется свет с высокой степенью монохроматичности. Обе эти проблемы были недавно решены путем использования в современных приборах лазеров. Это важный шаг вперед, так как КР-спектроскопия имеет то важное преимущество перед ИК-спектроскопией, что можно работать в растворах Н20. На рис. 14-23 показан типичный КР-спектр.
