Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
прямым углом к падающему лучу. Испускаемый свет затем проходит через второй монохроматор для анализа длин волн и в конце концов падает на светочувствительный детектор (обычно фотоэлектронный умножитель). Многие современные приборы имеют сканирующие системы и самописцы, с помощью которых автоматически изменяются длины волн и строится зависимость интенсивности излучаемого света от его длины волны.
Интенсивность света есть мера энергии ?, приходящейся на единицу площади за единицу времени. Поскольку чувствительность обычных детекторов света (например, фотоумножителей) зависит от длины волны и поскольку E = hc/K, отношение выходных сигналов (электрического тока) фотоумножителя, когда на него падает излучение с двумя различными длинами волн, не такое, как отношение интенсивностей. Однако в большинстве экспериментов достаточно простого измерения выходного сигнала фотоумножителя, потому что при каждой длине волны обычно измеряются только относительные интенсивности — например, измеряется флуоресценция в присутствии и в отсутствие некоторого агента, при условии что данный агент не влияет на эффективность поглощения возбуждающего света. Тем не менее в не-
которых экспериментах необходимо измерить Q или определить распределение энергии по спектру флуоресценции; обе эти задачи требуют измерения абсолютной интенсивности. В обычных методах измерения интенсивности флуоресценции требуется калибровка фотоумножителя с помощью термоэлемента — прибора, способность которого измерять энергию падающего света не зависит от длины волны. Эту калибровку проводят с помощью некоторых промышленных спектрофлуориметров или используют прибор, называемый счетчиком квантов.
Важно знать, что при представлении спектров флуоресценции в журнальных статьях не часто делаются различия между исправленным и неисправленным спектром. Обычно вычерчивают спектр в виде зависимости выходного сигнала фотоумножителя от длины волны. Это неисправленный спектр. Нанесение на график интенсивности флуоресценции или квантового выхода дает исправленный спектр. Если на графике отложена величина выходного сигнала фотоумножителя, то называть ее флуоресценцией или интенсивностью флуоресценции неправильно. Вероятно, если не оговорено, как получен данный спектр, надежнее допустить, что он является неисправленным.
Для измерения Q требуется подсчет фотонов, так как
q _ излученные фотоны ^
поглощенные фотоны v '
Отметим, что Q — безразмерная величина. Так как энергия Е одного фотона определяется уравнением E = hv, для измерения числа фотонов требуется измерить величину энергии светового потока и разделить ее на величину hv. Измерение абсолютного квантового выхода — трудный и утомительный процесс, в биохимических целях его проводят крайне редко. (Методики измерений даны в избранной литературе, приведенной в конце этой главы.) При обычном методе измерения Q требуется провести сравнение с флуоресцирующим веществом, Q которого известно; готовят два раствора: один — образца, другой — стандартного флуоресцирующего вещества — и измеряют интегральную флуоресценцию (т. е. площадь, ограниченную спектром) каждого, используя один и тот же источник возбуждения.
Квантовый выход Qx образца X равен
I Q А
Qx=—] а......"¦ <2>
S X
где Qs — квантовый выход стандартного вещества, 1Х и Is — интенсивности флуоресценции образца и стандартного вещества
соответственно и Ах и As — поглощение (оптическая плотность) каждого раствора при длине волны возбуждения. Обычно растворы подбирают таким образом, чтобы Ах = А$.
И еще раз необходимо напомнить о традициях представления данных. Очень часто опубликованные спектры изображаются в виде зависимости Q от Я, а также интенсивности флуоресценции при определенной длине волны выдаются за величину Q. На самом деле редко когда измеряется Q. Эта непоследовательность возникает из-за того, что так как при биохимических исследованиях обычно измеряют относительные интенсивности при двух различных условиях (например, в условиях, когда есть тушение или нет его) и, следовательно, используют данные двух спектров, соотношение относительных величин Q такое же, как интенсивностей флуоресценции.
Изучение белков путем измерения их собственной флуоресценции
При флуоресцентном анализе макромолекул используются два типа флуоресцирующих хромофоров: собственные флуоресцирующие хромофоры (содержащиеся в самих макромолекулах) и внесенные флуоресцирующие хромофоры (добавленные в систему и обычно связывающиеся с одним из компонентов). Вначале рассмотрим собственную флуоресценцию.
Белки содержат только три собственных флуоресцирующих хромофора — остатки триптофана, тирозина и фенилаланина (перечислены в порядке убывания Q). Флуоресценцию каждого из них можно отличить по соответствующей длине волны, при которой она возбуждается и при которой она наблюдается. На практике больше всего изучают флуоресценцию триптофана, потому что фенилаланин имеет очень низкий Q, а флуоресценция тирозина часто очень слаба из-за тушения. Флуоресценция тирозина почти полностью потушена, если он ионизован или расположен недалеко от аминогруппы, карбоксильной группы или триптофана. В особых ситуациях, однако, ее можно обнаружить, проводя возбуждение при 280 нм.
