Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Фрайфелдер Д. -> "Физическая биохимия " -> 152

Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.

Фрайфелдер Д. Физическая биохимия — М.: Мир, 1980. — 580 c.
Скачать (прямая ссылка): fizicheskayabiohimiya1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 146 147 148 149 150 151 < 152 > 153 154 155 156 157 158 .. 218 >> Следующая

* Не все переходы возможны. Разрешенные переходы определяются правилами отбора квантовой механики.
РИС. 15-2.
Спектры поглощения и флуоресценции триптофана.
/ — зависимость молярного коэффициента погашения от длины волны; 2 — спектр испускания в произвольных единицах,
вень Si энергия теряется, испускаемый свет имеет меньшую энергию (т. е. большую длину волны), чем поглощенный свет. Следовательно, длина волны испускаемого света больше, чем возбуждающего. Однако, возвращаясь на уровень G, молекула вместо «абсолютного» основного состояния может попасть на один из колебательных уровней G; эта колебательная энергия будет также рассеиваться в виде тепла. Следовательно, если имеется много соответствующих подуровней, испускаемый свет будет иметь различные длины волн (как правило, все они больше, чем длина волны поглощенного света); форма спектра флуоресценции определяется набором (густотой) всех переходов с нижнего колебательного уровня первого возбужденного состояния на каждый колебательный уровень основного состояния. Типичные спектры поглощения и флуоресценции показаны на рис. 15-2.
Как было сообщено ранее, возбужденная молекула не всегда флуоресцирует. Эффективность флуоресценции описывается квантовым выходом Q, а именно отношением числа излученных к числу поглощенных фотонов. (Фотон представляет собой порцию света, имеющую энергию ? = /iv, где h — постоянная Планка и v — частота световой волны.) Q определяется несколькими факторами; одни из них связаны со свойствами самой молекулы (внутренние факторы), другие — со свойствами окружения. Внутренние факторы определяются распределением колебательных уровней состояний G и S. Например, если колебательный уровень VG основного состояния имеет ту же самую энергию, что и колебательный уровень более низкого порядка Vs первого возбужден-
ного состояния, может иметь место безызлучательный переход (здесь не обсуждается) с Vs на VG (рис. 15-1, Б), который сопровождается превращением энергии VG в тепло. Именно так обычно и происходит с гибкими молекулами, потому что для них характерны очень высокие колебательные уровни в G (см. рис. 15-1, Б). На самом деле это наиболее общий путь рассеяния энергии возбуждения; им объясняется тот факт, что флуоресцирующие молекулы (флуорофоры *) редки и что те, которые флуоресцируют, почти всегда являются довольно жесткими ароматическими кольцами или системами колец.
Внутренние факторы обычно не представляют интереса для биохимиков, занимающихся изучением свойств макромолекул; факторы окружения имеют более важное значение. Действие этих факторов проявляется в первую очередь в появлении безы-злучательных переходов, которые конкурируют с флуоресценцией и вследствие этого понижают величину Q; это понижение Q называется тушением. В биологических системах тушение обычно является либо результатом столкновений (химическая реакция или просто столкновение с обменом энергии), либо результатом безызлучательного дальнего переноса энергии, называемого резонансным переносом энергии (он будет обсуждаться далее в тексте). В экспериментальных условиях (в растворах) эти три фактора обычно проявляются как эффект растворителя или растворенных соединений (называемых тушителями), температуры, pH, соседних химических групп или концентрации флуоресцирующих молекул. В последующих разделах будет обсуждаться, как можно использовать сведения о влиянии окружения на хромофор для изучения макромолекул.
Аппаратура для измерения флуоресценции
На рис. 15-3 показана стандартная схема для измерения флуоресценции. Пучок света высокой интенсивности проходит через монохроматор для выделения требуемой длины волны возбуждения (флуоресцирующая молекула эффективно поглощает свет этой длины волны). Возбуждающий свет далее проходит через кювету с образцом. Чтобы исключить влияние падающего света, воспользовались тем фактом, что флуоресценция испускается во всех направлениях, так что ее можно наблюдать, например, под
* Далее в тексте вместо термина «флуорофор» будут использоваться более принятые в отечественной литературе термины: «флуоресцирующий хромофор» или «флуоресцирующая молекула». — Прим. перев.
2 4
8
РИС. 15-3.
Схема устройства спектрофлуориметра.
Образец испускает флуоресценцию во всех направлениях, но в большинстве систем регистрируется только излучение, наблюдаемое под углом 90° к направлению возбуждающего света. Отметим, что этот прибор отличается от спектрофотометра только тем, что в случае спектрофотометра регистрировался бы свет, прошедший через образец. Современные автоматические спектрофлуориметры снабжены самописцами, на которых вычерчивается либо зависимость выходного сигнала детектора от длины волны испускаемого света, либо зависимость выходного сигнала детектора при одной или нескольких длинах волн от длины волны возбуждающего света.
1 — источник света; 2 — монохроматор возбуждения; 3 — возбуждающий свет; 4 — держатель кюветы с образцом; 5 — прошедший свет; 6 — испускаемый свет; 7 — монохроматор испускания; 8 — детектор.
Предыдущая << 1 .. 146 147 148 149 150 151 < 152 > 153 154 155 156 157 158 .. 218 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed