Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
РИС. 14-20.
Обнаружение с помощью дифференциальной спектроскопии диссоциации овомакроглобулина на субъединицы, индуцируемой изменением pH; D2&7 при различных pH измеряли против D287 при pH 7.
РИС. 14-21.
Две из нескольких возможных структур дрожжевой аланииовой тРНК, построенных таким образом, что большая часть оснований участвует в образовании водородных связей. Водородная связь пары GC обозначена сплошной линией, пары A-U — точками, более слабые водородные связи, найденные для других пар оснований, обозначены волнообразной линией. Определение числа пар оснований различного типа по данным ЯМР показывает, что правильной является структура клеверного листа (слева).
Принятые обозначения: G — гуанозин; С — цитидин; А — аденозин; U — уридин; I — инозин; H2U — дигидроуридин; Т — рибозилтимин; MG — метилгуанозин; M2G — диметил-туанозин; Ч? — псевдоуридин; MI — метилинозин. [Последовательность оснований описана Holly R, W., Apgar J.t Everett G. AMadison J. Т., Marquisee М., Mertll S. H., Fens-wick J. R , Zamer A., Scionce, 147, 1462—1465 (1965).]
Этот процесс можно изучать с помощью дифференциальной спектроскопии; в этом случае для получения дифференциального спектра используют два раствора, которые идентичны во всем, кроме концентрации.
Пример 14-К. Пертурбация растворителем нуклеиновых кислот. Замена воды на 50%-ную D2O приводит к характерным из-менениям в спектрах мононуклеотидов, но не оказывает влияния на спектры пар оснований. Таким образом, изменения в спектре НК в 50%-ной D2O можно использовать для определения доли «оснований, которые не участвуют в образовании пар. Это особенно важно при изучении таких молекул, как транспортная РНК (тРНК). В тРНК последовательность оснований такова, что не все они образуют водородные связи; можно построить пространственные модели, в которых реализуется часть водородных связей (рис. 14-21). Согласно различным моделям, требуется, чтобы разнос число оснований было связано водородными связями; спектральные данные позволяют исключить некоторые возмож-
ные модели (см. гл. 17, в которой обсуждается ’роль ядерного магнитного резонанса в выборе возможных моделей тРНК путем измерения числа пар оснований, образующих водородные связи).
„Репортерные" группы
В молекуле, представляющей интерес для исследователя, часто содержится много хромофоров, но ни один из них не находится в участке, ответственном за биологическую функцию молекулы, или рядом с ним. Эту ситуацию удается иногда исправить, вводя в нужный участок дополнительный хромофор. Такой хромофор называется «репортерной» группой. Для успешного использования «репортерная» группа должна иметь спектр, отличный от остальной части макромолекулы, она должна присоединяться только в одно положение, и ее введение не должно влиять на способность макромолекулы к различным видам взаимодействия. Удобными «репортерными» группами являются диметил-аминоазобензол и арсаниловая кислота. Следующий пример иллюстрирует использование «репортерных» групп.
Пример 14-Л. Конформация карбоксипептидазы А. В активном центре фермента карбоксипептидазы А содержится тирозин, а в определенном положении вне активного центра — атом цинка. Путем диазотирования и последующего азосочетания можно присоединить арсаниловую кислоту к тирозину, находящемуся в активном центре. Спектр поглощения свободного арсанилазоти-розина значительно изменяется при связывании цинка. Спектр модифицированного белка в растворе такой же, как спектр модельного цинкового комплекса. Значит, белок упакован таким образом, что место расположения цинка и активный центр находятся недалеко друг от друга. Это особенно интересный пример, так как при изучении кристаллов с помощью рентгеноструктурного анализа показано, что цинк не располагается вблизи активного центра. Однако спектр «репортерной» группы в кристалле белка также свидетельствует об отсутствии связывания цинка. Следовательно, структура белка в растворе не такая, как в кристаллах, используемых для рентгеноструктурного анализа.
Следует отметить, что эта методика сходна с методом флуо* ресцентных меток и проб (см. гл. 15).
Поглощение поляризованного света
Плоскость поляризации электромагнитной волны определяется как плоскость вектора Е (рис. 14-1, см. также гл. 16, где более полно описывается поляризация и возникновение плоскополяри-зованного света). Обычный луч света не поляризован, так как «го можно представить как набор волн со случайно ориентированными плоскостями поляризации. Однако плоскополяризован-ный свет можно получить, либо пропуская свет через различные вещества, либо путем отражения от поверхности под критическим углом.
Все хромофоры имеют по крайней мере одну ось, вдоль которой преимущественно поглощается плоскополяризованный свет. Например, вероятность поглощения света гексаметилбензолом, представляющим собой симметричное плоское кольцо
СНз
I
сн3—j^V-CH*
СН3 н3
