Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
КР-спектроскопия пока не имеет широкого распространения. Рассмотрим несколько возможных применений этого метода, описанных в литературе.
Доказательство цвиттер-ионного строения различных аминокислот. Ионизация амино- и карбоксильной групп сопровождается характерными изменениями в спектрах.
Распознавание аденозинмоноди- и трифосфата и их ионизованных форм в растворе. Метод используется для изучения некоторых ферментативных реакций, потому что по КР-спектру реакционной смеси можно определить относительные количества молекул каждого типа в процессе реакции или в равновесии.
Определение содержания в полиаминокислотах: а-спиралиг р-структуры и беспорядочного клубка. Как и в случае ИК-спек-троскопии, наблюдаются характерные амидные полосы, интенсивность которых пропорциональна относительному содержанию структуры каждого типа.
Определение числа S—S-связей в белках. S—S- и S—Н-связл дают характерные vMaKC.
Определение числа спаренных и неспаренных оснований в РНК. Каждое основание можно отличить по его КР-спектру, так что по относительной интенсивности пиков, соответствующих каждому основанию, можно определить состав оснований. Кроме того спектры меняются при дейтерировании, поэтому удается идентифицировать места медленного и быстрого обмена дейтерия на водород. Считают, что основание, для которого наблюдается медленный обмен, находится в составе пары, поскольку водородные связи препятствуют обмену (см. пример 14-К).
Список литературы
Beaven G. Н., Johnson Е. A., Willis Н. АMiller R. G. J., Molecular Spectroscopy, Heywood, 1961.
Brewer J, M., Pesce A. I., Ashworth R. B.> Experimental Techniques: in Biochemistry, Prentice-Hall, 1974, ch. 7.
Donovan J. W. Ultraviolet Difference Spectroscopy: New Techniques and Applications and Spectrophotometric Titration of the Functional Groups of Proteins, in “Methods in Enzymology”, vol. 27, edited by С. H. W. Hirs and
S. N. Timasheff, Academic Press, 1973, pp. 497—525; 525—548.
Edisbury J. R.t Practical Hints of Absorption Spectrometry, Helger-Watts, 1965.
Herskovitz J. TDifference Spectroscopy, in “Methods in Enzymology”, vol. 11, edited by С. H. Hirs, Academic Press, 1967, pp. 748—775.
Horton H. RKoshland D. Environmentaly Sensitive Groups Attached to Proteins in “Methods in Enzymology”, vol. 11, edited by С. H. W. Hirs, Academic Press, 1967, pp. 856—870. Описание использования репортерных групп.
Timasheff S. N., Some Physical Probes of Enzyme Structure in Solutions, in “The Enzymes”, vol. 2, edited by P. D. Boyer, Academic Press, 1970, pp. 371—443.
Задачи
14-1. Поглощение раствора, содержащего вещество с молекулярным весом 423 в концентрации 32 мкг/мл, составляет 0,27 при 540 нм в односаити-метровой кювете. Чему равен коэффициент молярного погашения при 540 нм? Допустить, что закон Бера соблюдается.
14-2. Раствор соединения А имеет ?>260=0,45 и ?>450=0,03. Раствор второго соединения Б имеет ?>2бо=0,004 и ?>45О=0,81. 2 мл раствора А смешали с 1 мл раствора Б. Результирующая оптическая плотность смеси Дгео^О.З и ?>450 = 0,46. Имеется ли взаимодействие между А и Б? Объяснить. Какое допущение делается, чтобы подтвердить это заключение?
14-3. Допустим, что только что приготовлены два образца: один — нативной ДНК и другой — денатурированной ДНК— и каждый диализован против 0,01 М NaCI. Затем добавляют к каждому раствору очень маленькое количество фермента и снимают этикетки с образцов. Как путем измерения поглощения можно установить природу каждого образца? Можно принять, что в опыте расходуется небольшая часть каждого образца и что фермент не мешает опыту. Придумайте другой опыт, в котором не требуется введения денатурирующего агента или создания условий, вызывающих денатурацию.
14-4. Предположим, что вы захотели узнать, сколько цитохрома с содержится в одной клетке Е. coli. Известен молярный коэффициент погашения в максимуме поглощения. Как вы проделаете это измерение?
14-5. Молярный коэффициент погашения данного соединения 348 при 482 им. Раствор этого соединения имеет ?>4$2=1Д При разбавлении 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 и 1:6 величины ?>482 составляют 1,52, 1,42, 1,05, 0,84, 0,70 и
0,61 соответственно. Какова молярность исходного раствора?
14-6. Молярные коэффициенты погашения вещества А при 260 и 280 нм равны соответственно 5248 и 3150. Для выделения А используется реагент Б, имеющий молярные коэффициенты погашения 311 и 350 при 260 и 280 нм. После выделения А ?>2бо=2,50 и D28o = 2,00. Какова концентрация А?
14-7. D26o денатурированной ДНК [измеренная при той температуре, когда достигается максимальная Z)26о (см. рис. 14-13)] постоянно на 37% выше, чем D нативной ДНК, например, при 20°С. Однако в 6 М растворе трифтор-ацетата натрия D2eo образца ДНК только на 16% выше, чем при 20°С. Предложите объяснение этого.
14-8. Белок помещают в 20%-ный раствор этиленгликоля и снимают его дифференциальный спектр против раствора, не содержащего этиленгликоля. При всех длинах волн Де=0. Что вы можете заключить о структуре белка?
