Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
I С
СН3
максимальна, когда вектор Е находится в плоскости кольца, и равна нулю, когда он перпендикулярен этой плоскости. Если в молекуле имеются оси симметрии различной длины, как в случае плоской молекулы нафталина
111
то поглощение происходит только тогда, когда вектор Е лежит в плоскости кольца, но вероятность поглощения зависит от того, параллелен ли вектор Е длинной или короткой оси молекулы. Этот эффект называется дихроизмом; он определяет различные значения величины е для отдельных направлений. Его удобно использовать, определяя ориентацию молекул в биологических системах. Этот эффект описан детально в гл. 2 в разделе, посвя-щенном поляризационной микроскопии. При исследованиях макромолекул он наиболее часто используется в инфракрасной спектроскопии для определения ориентации отдельных связей по отношению к оси молекулы. Это будет описано в следующем разделе.
Инфракрасная спектроскопия
В результате поглощения света в ИК-области (от 103 до 105 нм (рис. 14-3) происходят переходы между колебательными уровнями основного состояния молекулы. Колебательные уровни и, следовательно, ИК-спектры возникают за счет характеристических движений (растягивания связей, изменения величины углов между связями и более сложных типов движений) различных функциональных групп (например, метильной, карбонильной, амидной и т. д.). Ценность спектрального анализа в ИК-области обусловлена тем, что вид колебаний каждой группы очень чувствителен к изменениям химической структуры, конформации и окружения, и в этом смысле ИК-спектроскопия не отличается от спектроскопии в видимом и ультрафиолетовом свете. Этот метод рассматривают отдельно, главным образом ввиду некоторых отличий в методологии и ввиду того, что он может быть использован для изучения химических групп, которые нельзя исследовать с помощью абсорбционной спектроскопии в ультрафиолетовом и видимом свете.
Техника измерения ИК-спектров
Инфракрасные спектрофотометры в принципе не отличаются от спектрофотометров, работающих в ультрафиолетовом и видимом свете. Источником излучения является тело, нагреваемое до 1500—1800 К, для выделения длин волн используется монохроматор, но в качестве детектора применяется термопара (вместо фотоэлемента).
Главная трудность ИК-спектроскопии состоит в том, что нельзя использовать водные растворы из-за очень сильного поглощения воды в ИК-области (так как она имеет высокий коэффициент погашения я ее концентрация составляет 55 моль/л). Эту трудность можно частично обойти, используя D2O или смеси Н2О—D2O. Иногда также используют хлороформ, потому что в нем растворяются многие полярные молекулы, но хлороформ индуцирует конформационные изменения. Наиболее общим приемом, позволяющим изучать макромолекулы, является использование тонких, достаточно сухих пленок. Их готовят растворением вещества в летучем растворителе, затем раствор помещают на плоскую пластинку и дают возможность растворителю испариться; образовавшуюся пленку снимают с пластинки. Если необходимо приготовить пленки, в которых все молекулы ориентированы в одном и том же направлении, их растягивают. Такие пленки пригодны для работ в поляризованном свете, с помощью которого можно определять ориентацию отдельных групп по от-
ношению к оси молекулы. Конечно, всегда необходимо принимать во внимание, что структура макромолекулы в сухой пленке отличается от таковой в растворе.
Информация, содержащаяся
в инфракрасных спектрах
Во-первых, необходимо отметить, что при изображении инфракрасных спектров традиционно используются волновые числа 1Д или частоты v, а не длины волн. В терминах частот каждая полоса в ИК-спектре может быть охарактеризована частотой максимума поглощения умакс, шириной полосы на половине высоты AVi/2, оптической ПЛОТНОСТЬЮ при Умакс (Амане) И формой полосы *. Для ориентированных пленок измеряется дихроичное отношение (R), т. е. отношение площадей полос, полученных, когда электрический вектор световой волны параллелен и перпендикулярен оси молекулы. В результате многочисленных исследований мономеров известной структуры теперь достоверно установлено, какой группе и какому типу колебаний соответствует каждая полоса в спектре. В случае простых соединений ИК-спектры отличаются от спектров в видимом и ультрафиолетовом свете тем, что они обычно состоят из довольно узких лилий (рис. 14-22). Однако в случае макромолекул так велико число типов связей и так много различных конформаций, что каждая полоса смещается в той или иной степени в зависимости от
* Волновое число l/A,=v/c, где с — скорость света в вакууме. Единицы, в которых выражаются v и 1Д, — это с-1 и см-1 соответственно.
2000 1500 1200
Волновое число, см'1
РИС. 14-22.
Инфракрасные спектры ДНК (Л и стеариновой кислоты (2). Отметим наличие широких полос в спектре ДНК.
положения соответствующей группы в молекуле, так что все полосы перекрываются и вследствие этого в спектре содержится несколько относительно широких полос (рис. 14-22).
