Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Применение поляризации флуоресценции для изучения белков и нуклеиновых кислот
Применяя этот метод для изучения белков, воспользовались главным образом тем фактом, что изменения поляризации обусловлены изменениями подвижности либо всей молекулы, либо €е части *.
Для наблюдения деполяризации, обусловленной этим движением, необходимо достаточно длительное время жизни возбужденного состояния, чтобы до испускания могла происходить переориентация. Как для белков, так и для нуклеиновых кислот время жизни собственной флуоресценции обычно слишком коротко, хотя в случае небольших белков (AJ<20 000) можно получить некоторую информацию, изучая деполяризацию флуоресценции триптофана. Обычно в поляризационном анализе используются «внесенные» хромофоры.
Для интерпретации данных, полученных путем поляризационных измерений (как и в других методах) используется ряд правил. Основное правило и некоторые общие следствия приведены в табл. 15-2.
В следующих примерах описывается, какую пользу можно извлечь из метода поляризации флуоресценции.
Пример 15-М. Изучение связывания с использованием поляризации флуоресценции. Если антиген со введенной флуоресцентной
* Отметим, что обсуждаемая подвижность является вращением, потому что поступательное движение не будет вызывать деполяризацию. Однако если молекула свободно движется, соударяясь с молекулами растворителя (т. е. путем броуновского движения), очень маловероятно, чтобы она могла двигаться без вращения. По этой причине подвижность может также пониматься в общем смысле просто как способность двигаться.
ТАБЛИЦА 15-2
Основное правило для интерпретации данных по поляризации флуоресценции и несколько следствий из него
Правило
При возрастании подвижности поляризация уменьшается Следствия
7. Поляризация фактически не проявляется для несвязанных флуоресцирующих хромофоров в растворе, так как они быстро и свободно вращаются* Однако, если они связываются с молекулой, имеющей небольшой молекулярный вес, их поляризация возрастает вследствие некоторого уменьшения подвижности
2. Если флуоресцирующий хромофор связан с макромолекулой, поляризация может стать значительной благодаря сильному уменьшению подвижности. Степень поляризации зависит не только от подвижности всей макромолекулыг но также от подвижности места связывания. Например, если флуоресцирующий хромофор интеркалирует между основаниями ДНК, он прочно удерживается на месте, так что его подвижность — это подвижность молекулы ДНК; если он связан с длинной боковой цепью аминокислоты, его поляризация будет отражать как подвижность всего белка, так и свободу движения боковой цепи по отношению к полипептидной цепи
3. Если с макромолекулой связан флуоресцирующий хромофор и макромолекула агрегирует (например, димеризуется) или связывается с большой молекулой, поляризация возрастает вследствие понижения подвижности частиц
4. Если с макромолекулой связан флуоресцирующий хромофор, и макромолекула претерпевает конформационную перестройку (например, переход спираль — клубок), поляризация уменьшается, когда молекулярная структура становится более беспорядочной, и увеличивается, когда она становится более упорядоченной
меткой взаимодействует с антителом, поляризация флуоресценции возрастает благодаря уменьшению подвижности антигена в комплексе антиген — антитело (следствие 3 в табл. 15-2). Этот эффект может быть использован при изучении связывания целого ряда меченных флуоресцеином антигенов — нап'ример, рибо-нуклеазы, сывороточного альбумина быка, 0-цепи инсулина — с соответствующими антителами. Выполняя простые операции^ удалось получить константы равновесия и определить стехиометрию связывания; эти данные увеличили наши знания о механизме реакции антиген — антитело.
Связывание флуоресцирующего субстрата ферментом приводит к увеличению поляризации за счет уменьшения подвижности флуоресцирующего хромофора (следствие 2 в табл. 15-2). Этог эффект является чувствительной пробой на наличие фермент-субстратного связывания и может быть использован для определения тех параметров, измерение которых зависит от точного знания количества связанного субстрата (например, констант связывания, стехиометрии).
Пример 15-Н. Обнаружение ассоциации белков. Поляризация флуоресценции ДНС-производных а-химогрипсина, химотрипси-ногена и лактатдегидрогеназы возрастает, когда белки самоас-социируют, так как увеличение размера частицы приводит к понижению подвижности (следствие 3 в табл. 15-2). Следовательно, измеряя изменения поляризации, можно исследовать само-ассоциацию и диссоциацию. Этим путем можно изучать эффекты pH, ионной силы и состава растворителя, так как они оказывают небольшое влияние (или совсем не влияют) на саму поляризацию (т. е. если ферменты так разбавлены что ассоциация невозможна; изменений поляризации под действием этих факторов не наблюдается).
С использованием поляризации флуоресценции ДНС-производных лактатдегидрогеназы (ЛДГ) мышцы (М) и сердца (С) быка была довольно изящно изучена гибридизация этих белков, приводящая к образованию тетрамеров. Некоторые условия (например, низкие величины pH) приводят к понижению и поляризации, и ферментативной активности. Так как понижение поляризации указывает на возрастание подвижности или уменьшение молекулярных размеров, эти условия, по-видимому, вызывают диссоциацию тетрамера на мономеры. Переведя С-ЛДГ и М-ЛДГ в предполагаемое мономерное состояние, их обеих можно подвергнуть такой обработке, чтобы ввиду реассоциации возросла поляризация и ферментативная активность. Если до реассоциации смешать диссоциированные С-ЛДГ и М-ЛДГ, то будет тот же эффект, указывающий на то, что в смеси один из ферментов не препятствует реассоциации другого. Если продукт реассоциации затем вновь подвергнуть действию низких pH и, измеряя поляризацию как функцию времени, определить кинетику диссоциации, оказывается, что, согласно кинетике диссоциации реассоциированной смеси, в системе присутствует более двух компонентов. При разделении реассоциированной смеси было показано, что присутствуют гибридные тетрамеры (например, тетрамер, имеющий 3 С-субъединицы и 1 М-субъединицу) и что кинетика диссоциации каждого из них различается. Отметим, что для исследования диссоциации —реассоциации просто использовали величину Р и что этот способ является общим для обнаружения гибридизации.
