Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
использованы для определения ориентации ДНК в хромосо-мах *.
Пример 15-Т. Определение вязкости внутри живых клеток.. Если флуоресцирующая молекула очень быстро по сравнению со временем жизни возбужденного состояния меняет свою ориентацию, то поляризации флуоресценции не будет или она будет очень слабой (следствие 1 в табл. 15-2). Однако, если она находится в очень вязкой среде, так что ее движение сильно замед-ленно, поляризация будет наблюдаться. При приблизительно известном времени жизни флуоресценции (и, действительно, времена жизни могут быть измерены) можно определить вязкость среды. Отметим, что в данном случае мы не рассматриваем свойства макромолекулы, а лишь определяем вязкость жидкости, чего нельзя сделать путем прямых вискозиметриче-ских измерений. Была измерена внутриклеточная вязкость в асцитных клетках мыши и в бактерии ?. coli, причем предварительно эти клетки «поглотили» флуоресцирующую аминокислоту, аминонафтилаланин. Появляется небольшая поляризация; так как известно, что эта аминокислота не связывается ни с какими большими молекулами в клетках, наблюдаемую поляризацию можно использовать для подсчета внутриклеточной вязкости. Это представляет интерес, поскольку появляется возможность оценить скорости диффузии в пределах клетки и определить, могут ли некоторые реакции, лимитируемые диффузией, входить в последовательности реакций, которые составляют различные регуляторные метаболические пути.
Поляризационный анализ
с возбуждением в импульсном режиме
Флуоресцентный поляризационный анализ может быть использован для количественного определения коэффициентов враща-тельной диффузии. Применение для этой цели стандартного метода измерения поляризации флуоресценции имеет два неудобства: 1) с его помощью измеряется усредненная величина, что нежелательно, когда молекула имеет два вращательных коэффициента (например, палочкообразная молекула может вращаться вокруг своей длинной оси или переворачиваться так, что вверху оказывается то один конец, то другой), и 2) он требует измерения собственной поляризации, что выполняется путем изучения поляризации в растворах с возрастающей вязкостью и экстраполяции к бесконечной вязкости. Такая экстраполяция часто не имеет успеха, потому что вещества, добавляемые для увеличения вязкости, иногда оказывают влияние на конформа-
* Maclnnes /. W.f Uretz R. В., Science, 151, 689—691 (1966).
цию. Этих осложнений удается избежать, используя метод нано-секундного импульса, в котором возбуждение достигается с помощью наносекундного (10~9) импульса поляризованного света и регистрируются интенсивности испускаемого света в параллельном (/и ) и перпендикулярном (1 ±) относительно возбуждающего света направлениях. Для вращающейся молекулы имеется начальная разница в этих интенсивностях, которая затухает через несколько наносекунд, так как молекула поворачивается в результате броуновского движения. Скорость затухания связана с вращательным коэффициентом диффузии.
Данные анализируются следующим образом. Измеряют величину анизотропии испускания А как функцию времени;
/ (/) — /„ (/) -з*/Р
A(t) = ----LL- = А0е . (8)
/±(О + 2/0(О
где А0 — анизотропия в момент возбуждения и р — время вращательной релаксации. Зависимость lg А от / обычно линейна и имеет наклон —3/р. Если вещество имеет два времени вращательной релаксации, это будет проявляться в наличии двух связанных линий на кривой зависимости lgy4 от t (рис. 15-14). Ниже следует пример использования этого метода.
Пример 15-У. Факторы, определяющие р для химотрипсина. К активному центру а-химотрипсина может быть присоединена антранилоильная группа. С помощью метода наносекундного импульса найдено одно значение р, равное 52 не. Эта величина р может отражать либо гибкость места связывания антрани-лоильной группы, либо вращение всего белка (следствие 2 в табл, 15-2). Если допустить, что фактически антранилоильная группа движется независимо от белка, можно рассчитать (из времени вращательной релаксации антраниловой кислоты), что р приблизительно равно 1 не, что несовместимо с измеренной величиной. Если допустить, что белок представляет собой вра-
РИС. 15-14.
Зависимость логарифма анизотропии испускания от времени для молекулы, имеющей одно (Л) и два (?) времени вращательной релаксации,
щающуюся негидратированную сферическую частицу, то p=3r]V7?7\ где г]—вязкость растворителя, V — объем сферы, k — постоянная Больцмана и Т — абсолютная температура. Используя это уравнение и определяя V из молекулярного веса, вычисляют величину р. Она равна 22 не, т. е. тоже слишком мала. Следовательно, химотрипсин должен иметь больший V и должен либо быть гидратирован, либо иметь несферическую форму. Высокая величина р показывает также, что активный центр должен быть жестким.
Особые случаи использования флуоресценции в биологии и биохимии
Флуоресценция очень полезна не только для получения информации о конформации макромолекул или о расположении молекул внутри клеток, но и для локализации в пределах клеток и ткани и количественного анализа мельчайших количеств вещества. Далее следуют примеры нескольких таких применений.
