Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Х.нм
шее понижение е наблюдается для двухспиральных полинуклеотидов, так как основания в этом случае еще более упорядочены. Это показано на рис. 14-9.
В результате исследований большого числа биологически важных соединений и макромолекул, структура которых хорошо известна для различных условий, собран 'ряд эмпирических фактов, которые могут быть названы рабочими правилами абсорбционной спектроскопии в биохимии. Они приведены в табл. 14-2. Примеры использования этих правил будут даны в разделах следующего параграфа.
ТАБЛИЦА 14-2
Эмпирические правила интерпретации спектров поглощения биологических макромолекул
1. Если аминокислоты: триптофан, тирозин, фенилаланин и гистидин—перемещаются в менее полярное окружение, Амакс и е возрастают. Следовательно:
а. Если в снятом в полярном растворителе спектре аминокислоты, находящейся в составе белка, наблюдаются большие Хмакс и е, чем эти же величины для свободной аминокислоты в том же растворителе, то эта аминокислота находится во внутренней области белка («спрятана») и окружена неполярными аминокислотами.
б. Если спектр белка чувствителен к изменению полярности растворителя, аминокислота, для которой наблюдаются изменения ^макс и е» должна располагаться на поверхности белка.
2. В случае аминокислот ХмакС и е всегда возрастают, когда титруемая группа (например, ОН тирозина и SH цистеина) заряжена. Следовательно:
а. Если не наблюдается изменений в спектре одной из этих аминокислот, а pH таково, что должна бы происходить ионизация свободной аминокислоты, то она должна быть спрятана в неполярной области молекулы белка.
б. Если значение рК ионизуемой группы аминокислоты, определенное по изменению спектра при изменении pH, такое же, как для свободной аминокислоты в растворе, то эта аминокислота находится на поверхности белка.
в. Если значение рК, определанноз по изменению спектра при изменении pH, существенно другое, то эта аминокислота, вероятно, находится в очень полярном окружении (например, тирозин, окруженный карбоксильными группами).
3. Величина е пуринов и пиримидинов понижается по мере того, как плоскости их колец становятся параллельными и кольца сближаются друг с другом (по мере увеличения стэкинга). Величина ? понижается в следующем ряду: свободное основание > основание в составе одноцепочечного полинуклеотида, не имеющего стэкинга, > основание в составе одноцепочечного полинуклеотида со стэкингом > основание в составе двухцепочечного полинуклеотида.
Применение абсорбционной спектроскопии в видимой и УФ-областях спектра
Измерение поглощения проводится для многих целей: определения концентрации вещества, анализа некоторых химических реакций, идентификации веществ и определения структурных параметров макромолекул. Все эти области применения рассматриваются в следующих примерах.
Пример 14-А. Измерение концентрации. Наиболее часто измерения поглощения проводят для определения концентрации. Это можно делать, если известен молярный коэффициент погашения и соблюдается закон Бера. Например, для двухцепочечной ДНК ^260 = 1 соответствует 50 мкг/мл (эта величина зависит от нуклеотидного состава) *. Поскольку закон Бера соблюдается по крайней мере до D = 2 (которая приближается к пределу для большинства спектрофотометров), легко подсчитать концентрацию, а именно: D, равная 0,5, соответствует 25 мкг/мл, D, равная 0,1» соответствует 5 мкг/мл и т. д.
Иногда исследуемый материал состоит из частиц, поглощающих свет и образующих скорее суспензию, чем раствор; например, в случае бактериофагов, поглощение почти целиком определяется содержанием в них ДНК. Бактериофаги не только поглощают, но также рассеивают свет (рэлеевское рассеяние) и, следовательно, могут иметь искусственно завышенное поглощение. Однако, измеряя поглощение при ряде длин волн, далеких от Ямакс, можно сделать поправку на рассеяние. Так как рассеяние изменяется пропорционально Я-4, можно построить зависимость измеряемого поглощения от Аг4 и, экстраполируя линейную часть этой кривой (где все наблюдаемое поглощение обусловлено рассеянием) к Ямакс» внести поправку в измеряемое поглощение, равную величине, обусловленной рассеянием. Пример такой поправки показан на рис. 14-10. Это удобный метод определения содержания нуклеиновой кислоты в бактериофагах; учитывается также то, что D2m (с поправкой на рассеяние) — 1 соответствует концентрации ДНК 50 мкг/мл.
Концентрацию бактерий также часто определяют спекгрофо-тометрически, хотя при используемых длинах волн все кажущееся поглощение обусловлено рассеянием. В этом случае вместо поправки на рассеяние проводится сопоставление наблюдаемой оптической плотности с количеством жизнеспособных клеток и строится калибровочная кривая. Таким путем, как показано
* Для ДНК, содержащей 40% G-С-пар, Z>2so—l соответствует 40 мкг/мл.— Прим. ред.
Х,нм
РИС. 14-10.
Спектр поглощения фага Т7 Е. coli. Показана поправка на рэлеевское рассеяние.
1"
§ в
3 О
г; со
3 5 • 10®
5
