Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
А 1
нм ч I и I 11111 I I I I I III.I I I I II I I I
ГМ I I I I I П ТТТ ГТП I I I I М I I I I I I I I I I
<•) (•)
оТ ¦rminmriMTi гптгпгтптп
РИС. 13-9.
Л — процесс совпадения одноцепочечных разрывов в ДНК, приводящий к образованию двухцепочечных. Точками указаны места разрывов. Звездочками доказана пара разрывов, которые привели к двухцепочечному разрыву: они разделены только одной парой оснований, недостаточной для сохранения целостности молекулы. Б — зависимость вязкости ДНК фага Т2 от времени обработки панкреатической ДНКазой. ДНКаза приводит к одиоцепочечным разрывам, которые в конце концов совпадают и при этом получаются двухцепочечные разрывы, что приводит к уменьшению вязкости. Кривая сначала горизонтальна, так как одноцепочечные разрывы не оказывают влияния на вязкость. (5) Ожидаемая форма кривой (как и кривой Б) для кольцевой ДНК. В момент, когда образуется двухцепочечный разрыв, молекула становится линейной и вязкость будет возрастать. Вязкость не уменьшается до тех пор, пока не образуется второй двухцепочечный разрыв.
/ — нот разрывов; 2 — появились разрывы; 3 — число разрывов увеличилось, пока два die совпали; 4 — фрагментация.
S—S-мостиков, то остатки цистеина должны располагаться достаточно далеко вдоль полипептидной цепи, но не слишком ¦близко к ес концам.
Пример 13-В* Соотношение кольцевой и линейной форм в молекулах ДНК. В 1961 г. было показано, что генетическая карта фага Т2 Е. coli циклична. Поскольку в то время не представлялось возможным наблюдать ДНК в электронный микроскоп для того, чтобы оцепить кольцевую форму, исследовали изменение т]г единичного образца ДНК фага Т2, который непрерывно обрабатывался панкреатической ДНКазой. Этот фермент вызывает ¦одноцепочечные разрывы фосфоэфирных связей, которые накапливаются и в конце концов совпадают таким образом, что образуются двухцепочечные разрывы (рис. 13-9,Л). Эти одноцепочечные разрывы сами по себе не оказывают влияния на вязкость ДНК (рис. 13-9, Б) вследствие того, что жесткость молекулы поддерживается стэкинг-взаимодействием оснований (гл. 16). Следовательно, для линейной молекулы у\отп постоянна в течение всего периода, когда образуются только одноцепочечные разрывы, и уменьшается благодаря уменьшению молекулярной
оранжевого
РИС. 13-10.
А — проникновение молекул акридинового оранжевого между парами оснований ДНК- Молекула растягивается и становится более жесткой. В — зависимость длины ДНК фага % из Е. coli от концентрации акридинового оранжевого, определенная методом электронной микроскопии (получено в лаборатории университета Брандейс).
массы, когда появляются совпадения в разрывах. Однако, когда в кольцевой молекуле ДНК происходит первый двухцепочечный разрыв, молекула становится линейной и г\ (рис. 13-9, В) увеличивается; поскольку возрастает осевое отношение, цоти до тех пор не уменьшается, пока не произойдет двух двухцепочечных разрывов. Для ДНК фага Т2 т]0ти постоянна при обработке ДНКазой в течение нескольких часов, а затем уменьшается; это показывает, что данная молекула линейна.
Пример 13-Г. Доказательство методом вискозиметрии того, что некоторые вещества могут внедряться между гетероциклическими основаниями ДНК. Краситель акридиновый оранжевый Арочно связывается с двухцепочечной ДНК- Коэффициент седиментации (гл. 11) комплекса уменьшается по сравнению с коэффициентом седиментации свободной ДНК; это уменьшение может быть результатом либо деполимеризации, либо увеличения коэффициента трения, благодаря увеличению осевого отношения. Если уменьшение коэффициента седиментации обусловлено деполимеризацией, то [т]] должно понизиться, а если оно обусловлено увеличением коэффициента трения, то величина [г]] повысится. Экспериментально установлено, что величина [к\] комплекса больше, чем для свободной ДНК, так что осевое отношение комплекса должно быть больше, чем у свободной ДНК. Следова-
тельно, при связывании красителя должна увеличиваться длина ДНК. Исследования методом поляризации флуоресценции (гл. 15) показали, что краситель иммобилизован и располагается в той же плоскости, что и пары оснований. Таким образом, было сделано заключение, что краситель внедряется между основаниями в ДНК, увеличивая длину этой молекулы (рис. 13-10). Это заключение было подтверждено электронной микроскопией комплекса; ДНК становится длиннее и менее подвижной при связывании красителя.
Пример 13-Д. Обнаружение образования ДНК при ферментативной полимеризации мононуклеотидов. Если смесь ДНК и радиоактивных нуклеозидтрифосфатов инкубировать с ферментом ДНК~полимеразой I из Е. coli, часть радиоактивного материала переходит в форму, осаждающуюся кислотой (гл. 5, пример 5-1). Это может быть результатом чистого синтеза, приводящего к увеличению количества ДНК высокой молекулярной массы, или обмена нуклеотидов в исходных молекулах. Если имеет место чистый синтез, г|отн будет повышаться, поскольку увеличивается концентрация ДНК; если происходит только обмен, то количество ДНК не изменится и т)0Т„ будет постоянна. Во время, когда начиналась работа с полимеразой 1, ДНК можно было отличить от нуклеотидов по световому рассеянию (при использовании образцов с высокой концентрацией ДНК, не содержащих белка), ультрацентрифугированию или ультрафиолетовому поглощению (при низких концентрациях и в отсутствие избытка материала, поглощающего в УФ-области) или методом вискозиметрии. Ферментативная реакция проходит при низкой концентрации ДНК и высокой концентрации белка и УФ-поглощающих нуклеотидов; таким образом, первые три возможности исключаются. При исследовании вязкости было показано, что г| увеличивается при увеличении времени инкубации; это свидетельствует о том, что повысилось или количество ДНК, или ее молекулярная масса. Обе эти возможности подразумевают синтез ДНК.
