Физическая биохимия - Фрайфелдер Д.
Скачать (прямая ссылка):
Пример 13-Е. Конформация комплексов ДНК с гистонами. Гистоны — это белки, содержащиеся в хромосомах и связанные с ДНК. Для того чтобы понять роль гистонов в структуре хромосом и в регуляции экспрессии ДНК, исследовали структуру комплексов ДНК с гистонами.
При добавлении гистонов к ДНК коэффициент седиментации ДНК повышается. Повышение s означает либо увеличение молекулярной массы, либо уменьшение коэффициента трения (или осевого отношения). Характеристическая вязкость также увеличивается вследствие повышения либо молекулярной массы, либо осевого отношения. Качественно эти два результата могут подсказать, что молекулярная масса повышается. Однако, если до-
бавлено больше гистонов, соотношение s/[r\] заметно возрастает; это означает, что осевое отношение также понижается с увеличением количества связанного гистона. Следовательно, увеличение молекулярной массы при связывании гистонов сопровождается, возможно, некоторым складыванием ДНК.
Пример 13-Ж. Обнаружение процесса впрыскивания ДНК фагами. Фаги очень компактны по структуре и в связи с этим имеют для присущей им молекулярной массы очень низкую [ту]. При обработке некоторыми реагентами (например, щелочными буферами, NaClC>4 и хлоридом гуанидиния) происходит резкое повышение h] вследствие освобождения ДНК. Это можно использовать для измерения степени впрыскивания ДНК частицами. Следует тем не менее отметить, что, поскольку метод вискозиметрии позволяет измерять усредненное свойство раствора, бывает не легко различить следующие случаи: 100% фагов впрыскивают половину своей ДНК и половина фагов впрыскивает всю свою ДНК. Следовательно, если ряд условий приводит к меньшей величине т|, чем наблюдается при полном разрушении фагов, то полученную величину т] трудно интерпретировать. Эти два случая, конечно, можно различить при помощи опытов по седиментации, поскольку коэффициент седиментации зависит от впрыснутого количества. Следовательно, в первом случае будет наблюдаться единственный коэффициент седиментации, величина которого будет меньше, чем в случае интактных фагов, но больше, чем в случае свободной ДНК, во втором случае будет наблюдаться два вида седиментирующего материала — фаг и свободная ДНК.
Измерение вязкоэластичности растворов ДНК
Молекулы ДНК бактерий имеют молекулярную массу больше 2'109, а в животных клетках он достигает 10й. В таких пределах молекулярной массы использование гидродинамических методов затруднительно из-за сложных явлений, перечисленных в табл. 13-1. Заметьте, что описанный здесь метод вязкоэластичности не зависит от этих артефактов.
Если растворы ДНК подвергнуть напряжению сдвига, то молекулы ДНК растянутся, как показано на рис. 13-11. После снятия напряжения молекулы возвращаются в ненапряженную конфигурацию, при которой молекулы, если они очень длинные, приближаются к статистическому клубку. Раствор растягивающихся молекул обладает вязкоэластичностью, если его подверг-
А
РИС. 13-11.
Растягивание молекулы ДНК, после которого происходит вязкоэластичная релаксация при удалении напряжения.
А — до приложения напряжения; Б — растяжение при напряжении сдвига; В — релак-саци н.
ТАБЛИЦА 13-1
Проблематичные явления, с которыми встречаются в различных
гидродинамических методиках а
Явление Седнмента' Вискози Вязко
ция метрия эластичность
Седиментация, завис ящая от ско
рости + --- ---
Агрегация, зависящая от напряжения + + ---
+ + ---
Изменение при напряжении сдвига --- + ---
а Знак плюс означает, что проблема существует, а знак минус — не существует.
нуть деформации сдвига в вискозиметре типа вискозиметра Ку-этта. В случае модификации с погруженным ротором вискозиметра Зимма — Крозерса (рис. 13-8) после приложения напряжения сдвига внутренний цилиндр начинает вращаться. Когда напряжение сдвига снимают, то в том случае, если в вискозиметр налит чистый растворитель, угловая скорость постепенно приближается к нулю. Однако, если ротор помещен в раствор высокомолекулярной ДНК, направление вращения изменится на противоположное вследствие релаксации молекул ДНК, которые ранее были растянуты; в пределе ротор, конечно, остановится из-за трения. Экспоненциальная зависимость уменьшения скоро-
сти вращения ротора, который в конце концов остановится, может быть охарактеризована константой времени tr, называемой временем запаздывания (т. е. время, которое требуется для того, чтобы достичь l/е от общего углового смещения, которое происходит при обращении движения). Когда tr экстраполируется к нулевой концентрации ДНК, такое время называют временем релаксации tr°, и оно является истинным молекулярным параметром, который может быть соотнесен с молекулярной массой. Вследствие недостаточно в настоящее время разработанной теории, М для линейных молекул ДНК лучше всего определять из эмпирического уравнения
